摘要耳软骨细胞auricular chondrocytes, ACC是来源于耳廓弹性软骨的终末分化细胞具有分泌软骨基质、维持弹性软骨结构功能的特性在软骨组织工程和耳廓修复重建领域具有重要的研究价值。大鼠耳软骨细胞作为常用的实验模型其原代分离、培养与鉴定技术已较为成熟。本文系统综述了大鼠耳软骨细胞的生物学特性、原代分离方法、培养条件、鉴定标准及最新研究进展以期为相关研究提供参考。一、引言软骨组织工程是再生医学的重要分支而种子细胞的选择是组织工程软骨构建的核心环节之一。耳廓软骨属于弹性软骨与透明软骨和纤维软骨相比其基质中含有大量交织成网的弹性纤维赋予组织独特的柔韧性和弹性。耳软骨细胞作为耳廓组织工程最理想的种子细胞来源近年来在耳廓修复与重建、美容修复等研究中受到广泛关注。大鼠是耳软骨细胞研究中最常用的实验动物模型之一。建立稳定、高效的大鼠耳软骨细胞原代培养体系对于深入开展弹性软骨的生物学机制研究、组织工程软骨构建以及耳廓缺损修复等应用研究具有重要意义。二、耳软骨的组织学特点大鼠耳廓软骨属于弹性软骨是三种软骨类型透明软骨、弹性软骨、纤维软骨之一。与其他软骨相比弹性软骨的间质中含有大量交织成网的弹性纤维呈网状在软骨内排列同时含有少量胶原纤维。弹性软骨仅存在于高等动物的外耳廓、听道、会咽等处。软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成-。软骨细胞位于软骨组织的表层单个分布体积较小呈椭圆形长轴与软骨表面平行越向深层的软骨细胞体积逐渐增大呈圆形细胞核圆形或卵圆形染色浅细胞质弱嗜碱性常见数量不一的脂滴。大鼠耳软骨中还存在一类独特的“脂软骨细胞”其胞内含有脂肪滴使组织保持柔软和弹性。软骨组织的再生能力较强增生的幼稚细胞形似纤维母细胞随后逐渐分化为软骨母细胞并形成软骨基质-。三、原代分离方法大鼠耳软骨细胞的原代分离主要采用酶消化法。根据文献报道目前常用的分离流程如下1. 组织采集与预处理在无菌条件下取实验大鼠常用SD大鼠3-4周龄的耳廓组织-。将耳软骨收集于PBS中反复清洗以去除血液和结缔组织杂质。然后用无菌手术剪将软骨组织剪成约1 mm × 1 mm × 1 mm大小的组织块转入无菌离心管中。2. 两步酶消化法第一步胰蛋白酶预消化。向组织块中加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化约30 min期间反复洗涤、离心以去除软骨膜及周围结缔组织中的成纤维细胞。第二步Ⅱ型胶原酶消化。经胰蛋白酶预处理后加入2 mg/mL的Ⅱ型胶原酶溶液置于37℃水浴中轻微振荡消化直至软骨组织块基本消失、溶液变混浊为止一般需68 h-。对于残留的未消化组织可用1 mg/mLⅡ型胶原酶于37℃震荡消化过夜约1618 h。也有研究采用0.1% Ⅰ型胶原酶进行消化或使用Ⅱ型胶原酶过夜消化法-具体酶的选择和消化时间可根据实验条件和需求进行优化。3. 细胞收集与接种消化结束后用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液以去除未消化的组织碎片。将滤液以1200 r/min离心10 min弃去上清沉淀细胞用含10% FBS的DMEM/F12培养基重悬。将细胞悬液接种于培养瓶中置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。四、培养与传代1. 培养条件大鼠耳软骨细胞为贴壁生长细胞。推荐的培养体系为DMEM/F12基础培养基添加10%胎牛血清FBS、1%软骨细胞生长添加剂Chondrocyte growth supplement以及1%青霉素-链霉素双抗溶液。培养条件为37℃、95%空气和5%二氧化碳。有研究表明大鼠耳软骨细胞也可在含10% FCS的DMEM或DMEM/F12培养基中进行体外培养-。软骨细胞专用培养基中通常还添加1% ITS、20 ng/mL肝细胞生长因子HGF、40 μg/mL维生素C等活性成分。2. 细胞形态原代培养的大鼠耳软骨细胞呈梭状、不规则形态贴壁生长。在倒置显微镜下观察细胞呈典型的多角形或梭形。图.云克隆大鼠耳软骨细胞形态图3. 传代培养当细胞生长至80%90%融合时即可进行传代。常规传代比例为1:2每23天换液一次-。传代时使用胰蛋白酶进行消化但需注意消化时间不宜过长以免损伤细胞。需注意的是原代软骨细胞在体外单层培养传代过程中容易发生去分化dedifferentiation即逐渐丧失其软骨细胞的特异性表型-。研究表明重组人中期因子rhMK可显著促进大鼠原代耳软骨细胞的增殖并在传代过程中帮助细胞保留软骨形成潜能-。因此建议使用低代次细胞进行实验。大鼠耳软骨细胞的体外培养周期有限一般在23代内用于实验为宜-。五、细胞鉴定对原代培养获得的细胞进行鉴定是确认其是否为耳软骨细胞的必要步骤。1. 免疫荧光鉴定Ⅱ型胶原Collagen Ⅱ免疫荧光染色是大鼠耳软骨细胞鉴定的金标准-。Ⅱ型胶原是软骨细胞特异性分泌的细胞外基质蛋白其阳性表达可证实细胞的软骨细胞来源。2. 细胞纯度经Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定大鼠耳软骨细胞的纯度可达90%以上。3. 质量控制合格的原代耳软骨细胞应不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等污染。六、研究进展与应用前景1. 耳软骨细胞与组织工程耳软骨细胞是构建组织工程弹性软骨最理想的种子细胞-。近年来研究者利用人耳软骨细胞通过细胞扩增和3D打印技术制造工程软骨在大鼠体内植入六周后仍能保持形状和弹性-。这些组织工程化软骨在机械性能上已达到接近天然组织的水平。2. 细胞增殖与表型维持如何在大规模扩增的同时维持软骨细胞的特异性表型是该领域面临的核心挑战之一。研究发现重组人中期因子rhMK可通过激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶PI3K通路显著促进大鼠原代耳软骨细胞的增殖-。更重要的是经rhMK扩增的软骨细胞能够保留完整的软骨形成潜能在高密度培养条件下可重新分化为弹性软骨细胞-。3. 耳软骨细胞与干细胞研究的交叉大鼠耳软骨细胞还常被用于与干细胞共培养研究。研究者通过分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞比较了共培养和条件培养液两种不同方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点-。此外通过基因芯片技术筛选大鼠骨髓间充质干细胞与软骨细胞的差异表达基因有助于深入理解软骨分化的分子机制。4. 脂软骨细胞的新发现近年来的研究重新发现大鼠耳软骨中存在一类特殊的“脂软骨细胞”lipochondrocytes其胞内含有大量脂肪滴-。这一发现最早可追溯至1854年但长期被科学界忽视。利用现代生化工具和先进成像技术研究者正重新审视这一独特的细胞类型及其在维持耳廓弹性中的功能。七、结语大鼠耳软骨细胞的原代分离、培养与鉴定技术已较为成熟。采用Ⅱ型胶原酶消化法可从耳廓软骨组织中有效分离出高纯度的原代耳软骨细胞。所获得的细胞具有典型的梭状形态表达Ⅱ型胶原特异性标志物贴壁生长纯度可达90%以上。然而原代软骨细胞在体外传代过程中易发生去分化提示在实验中应尽量使用低代次细胞并关注表型维持策略的优化。随着组织工程技术和3D生物打印的不断发展大鼠耳软骨细胞作为重要的实验模型将在耳廓修复重建、弹性软骨再生医学等领域发挥更加重要的作用。武汉云克隆依托近二十年的原代细胞研发经验与SPF级实验动物中心现已构建起覆盖人、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪、羊、鸡、豚鼠等10多个物种的骨相关原代细胞资源库。在软骨细胞领域云克隆已实现关节软骨细胞AC、耳软骨细胞ACC、半月板软骨细胞MFCs 三大品类的全物种覆盖。关节软骨细胞AC系列是软骨细胞矩阵的核心产品覆盖人、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪、羊、豚鼠等多个物种。关节软骨细胞取自关节软骨组织采用胶原酶梯度消化法分离经Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定是骨关节炎机制研究、软骨损伤修复及抗骨关节炎药物筛选的核心细胞模型。耳软骨细胞ACC系列覆盖大鼠、小鼠、兔、犬、猫、山羊等物种。耳软骨细胞作为弹性软骨的代表为软骨组织工程研究提供重要参照广泛应用于耳廓缺损修复、气管重建及弹性软骨生物学研究。半月板软骨细胞MFCs系列覆盖大鼠、兔、犬、猫等物种。半月板软骨细胞取自半月板纤维软骨组织是研究半月板损伤修复、膝关节退行性病变及运动医学的重要细胞模型。