英文标题Xian-Lian-Jie-Du Decoction suppresses colorectal cancer liver metastasis by inhibiting Plaur/Hbegf/EGFR-mediated actin cytoskeleton remodeling中文标题仙连解毒汤通过抑制Plaur/Hbegf/EGFR介导的肌动蛋白细胞骨架重塑阻断结直肠癌肝转移发表期刊Phytomedicine影响因子11.3研究背景结直肠癌是全球重大公共卫生难题为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤。其中结直肠癌肝转移(Colorectal cancer liver metastasis, CRLM)是导致结直肠癌患者死亡的主要原因其进展不仅取决于肿瘤细胞的内在特性还依赖于恶性细胞与肝脏肿瘤微环境之间的动态相互作用促使肿瘤发生免疫逃逸、转移定植和治疗抵抗。因此鉴定可靶向的分子靶点并开发抑制CRLM的策略是当前研究热点。在中医药干预策略中仙连解毒汤(Xian-Lian-Jie-Du Decoction, XLJDD)已被证实具有抗结直肠癌活性可调控肿瘤代谢、改善肠道菌群稳态具备多靶点调控特征但该方抑制结CRLM的深层机制尚不清晰尤其缺少单细胞层面对于细胞骨架重塑及肿瘤微环境调控的阐释。现有研究表明PLAUR协同EGFR信号调控肌动蛋白骨架重塑推动肿瘤侵袭转移有望成为CRLM的治疗靶点。据此本研究整合转录组学与蛋白质组学分析、单细胞RNA测序、分子对接及多种实验验证手段系统探讨XLJDD对肌动蛋白细胞骨架重塑及肿瘤微环境重编程的影响旨在阐明XLJDD靶向抑制CRLM的分子机制为后续中医药防治提供新靶点与理论支撑。图形摘要研究结果01.XLJDD化学成分分析与质量控制首先研究采用UPLC-MS/MS技术对XLJDD颗粒制剂进行色谱分析共识别注释40个特征色谱峰图1明确了该药物颗粒的化学成分图谱。其中作为本研究后续重点探讨的Plaur靶点结合成分“环黄芪醇(Cyclogalegenin)”被明确识别并标记为特征峰19。图1.XLJDD颗粒的化学成分分析与质量控制02.XLJDD可减轻结直肠癌肝转移小鼠模型的肿瘤转移负荷基于CT26脾脏注射法建立结直肠癌肝转移小鼠模型图2A研究发现XLJDD有着良好的体内抗转移活性能够显著缓解肝脏转移程度图2B、降低肝指数图2D并减少肝脏表面转移结节数目图2E同时缩小转移病灶范围图2F加速肝转移灶肿瘤细胞凋亡图2G-H保护肝组织完整且无明显机体毒性图2C。这为后续深入开展分子机制研究提供可靠的体内表型基础。图2.XLJDD能够减轻CT26小鼠结直肠癌肝转移模型的肝脏转移负荷03.整合转录组学与蛋白质组学分析确Plaur/Hbegf轴为XLJDD的候选靶点为解析XLJDD抑制结直肠癌肝转移的分子机制研究对肝脏转移灶组织开展了匹配的转录组学和蛋白质组学分析。结果显示XLJDD在RNA和蛋白水平上引发了广泛的分子变化图3A-B其中Hbegf被鉴定为差异分子而Plaur则被锁定为密切相关的核心候选靶点图3C它们之间存在紧密的正相关及功能联系图3D-E并且均能被XLJDD显著下调其mRNA及蛋白水平的表达图3F-I。基于公共数据库的临床相关性分析显示PLAUR在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织图3J且在转移样本中的表达量较原发肿瘤进一步升高图3K结合生存分析PLAUR高表达与结直肠癌患者更短的总体生存期密切相关图3L。因此Plaur/Hbegf信号轴可作为XLJDD具备临床意义的候选作用靶点。图3.整合转录组与蛋白组分析及公共数据集验证支持Plaur/Hbegf轴作为XLJDD的候选治疗靶点04.scRNA-seq揭示XLJDD减少Plaur高表达恶性亚群并促进干扰素反应状态借助scRNA-seq分析研究开展了单细胞分辨率下XLJDD作用靶细胞及肿瘤微环境变化的解析其核心结果如下①针对恶性肿瘤细胞二次聚类肿瘤细胞显现明显异质性并划分多个恶性亚群图4A②MiloR差异丰度分析显示XLJDD能够大范围重塑恶性细胞亚群构成图4B减少Car6⁺恶性亚群、增加Ifit1⁺亚群图4C而Plaur主要在Car6⁺恶性亚群高表达图4D③透过拟时序分析可知XLJDD干预促使恶性细胞由终末Car6状态向Ifit1状态发生转变图4E④结合单细胞通路评分XLJDD显著改变肿瘤细胞脂肪酸、糖脂、氨基酸等多条代谢通路活性图4F并广泛调控代谢平衡、蛋白稳态及抗原递呈相关通路图4G。⑤根据转录因子分析结果XLJDD显著上调了Stat1、Irf1和Irf7等干扰素相关调控子的活性肿瘤向着I型干扰素响应状态转化图4H。综上XLJDD在单细胞层面有效削减了Plaur高表达的恶性细胞亚群并重塑肿瘤细胞向Ifit1干扰素反应性状态偏移。图4.scRNA-seq揭示了XLJDD治疗后恶性上皮细胞的异质性及治疗相关的状态转变05.XLJDD阻断高Plaur恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞间促转移信号交流为探究XLJDD对肿瘤微环境髓系区室的影响研究通过scRNA-seq分析发现XLJDD引发了髓系细胞状态的广泛重塑图5B并显著减少了Thbs1肿瘤相关巨噬细胞(TAM)亚群图5C。在该亚群中Plaur呈相对高表达图5D而XLJDD会促使细胞偏离终末Thbs1 TAM状态图5E。此外XLJDD还调控了髓系细胞脂质代谢、氧化磷酸化及干扰素相关转录程序推动细胞功能重编程图5F-G。在细胞间通讯方面以SPP1为中心的信号在转移微环境中被XLJDD显著削弱尤其是Spp1-Cd44信号轴该轴不仅介导了Car6⁺恶性细胞与Thbs1⁺ TAM之间的相互作用图5H而且受到肿瘤细胞Plaur活性的调控。因此XLJDD有效阻断了由肿瘤细胞Plaur活性驱动的Spp1-Cd44促转移串扰。图5.scRNA-seq揭示了XLJDD诱导的髓系细胞重塑与Car6⁺肿瘤细胞–Thbs1⁺ TAM细胞互作变化06.Plaur敲低在体外损害结直肠癌细胞的迁移、侵袭及肌动蛋白细胞骨架重塑通过构建稳定沉默及过表达Plaur的CT26细胞株研究证实Plaur的敲低显著抑制了结直肠癌细胞的迁移图6A-B与侵袭能力图6C-D同时存在131个基因均能受Plaur敲低和XLJDD治疗的影响所下调图6E。通路富集显示这些共同下调基因富集于Rho家族GTP酶相关信号表明Plaur与肌动蛋白细胞骨架动力学及丝状伪足形成密切相关图6F。qRT-PCR进一步验证Arhgef25、Cdc42ep1、Fscn1、Hbegf等靶基因的表达受Plaur调控图6G。细胞骨架结构方面Plaur敲低导致细胞极化减弱且丝状伪足数量显著减少图6H-I。此外公共数据库分析证实在人结直肠癌组织中PLAUR与FSCN1的mRNA表达呈显著正相关图6J。综上Plaur主要通过调控肌动蛋白细胞骨架重塑来驱动结直肠癌细胞的转移行为。图6.Plaur可抑制CT26细胞的迁移、侵袭以及肌动蛋白细胞骨架重塑07.Plaur促进Mmp9相关的Hbegf释放而XLJDD抑制Egfr/Erk信号通路及细胞骨架效应分子鉴于Plaur参与细胞周围蛋白水解及生长因子脱落研究首先证实了Plaur对Mmp9/Hbegf信号轴的调控作用Plaur的敲低或过表达可显著下调或上调CT26细胞中Mmp9及Hbegf的蛋白表达水平图7A-C同样地培养上清中分泌型Hbegf的水平也随Plaur的表达量呈现相应的变化趋势图7D表明Plaur与Mmp9/Hbegf信号密切相关。随后XLJDD对体内肝转移组织中下游信号及细胞骨架效应分子的抑制作用被进一步揭示XLJDD不仅呈剂量依赖性地下调了Fscn1、Arhgef25、Cdc42ep1和Rtkn的mRNA表达图7E也显著降低了转移性肝组织中Mmp9、Cdc42ep1和Fscn1的蛋白水平图7F-I及EGFR和ERK的磷酸化水平图7J–M。综合而言XLJDD通过抑制Mmp9/Hbegf信号轴及EGFR/ERK通路的激活进而下调了驱动肿瘤转移的关键细胞骨架效应分子。图7.Plaur相关Mmp9/Hbegf信号及XLJDD对EGFR/ERK通路与细胞骨架效应分子的抑制作用08.过表达Plaur可在体内削弱XLJDD的抗转移作用为验证XLJDD的抗转移作用是否依赖于Plaur的抑制研究利用对照CT26细胞(NC)和Plaur过表达细胞(Plaur-OE)开展了体内回补实验。结果显示Plaur过表达组显著削弱了XLJDD的抗转移疗效加重了肝转移、肿瘤负荷图8A-C在分子与病理层面上过表达组仍维持较高的Plaur水平并部分恢复了Hbegf、Fscn1和Cdc42ep1的表达图8D造成更广泛的肿瘤浸润与组织破坏图8EXLJDD对肿瘤细胞增殖的抑制作用被有效抵消图8F,I。同样地Plaur染色与Fscn1染色也证实过表达组中Plaur表达在XLJDD处理后仍维持较高水平图8G,JXLJDD对该骨架效应蛋白的抑制作用被Plaur过表达显著削弱图8H,K。综上这些结果确证了Plaur是XLJDD发挥抗结直肠癌肝转移作用的关键功能靶点。图8.Plaur过表达在体内削弱了XLJDD的抗转移效应09.环黄芪皂醇是XLJDD中一种组织可及的Plaur结合成分可抑制Plaur表达基于前文结果研究接着利用UPLC-MS/MS分析了小鼠血清与肝转移组织中XLJDD入血成分以筛选靶向Plaur的活性物质。结果显示萜类和甾体类衍生物为主要吸收成分图9A-C来源于XLJDD的多种组成药材图9D其中环黄芪皂醇图9E、柚皮素等多种成分具备与Plaur结合的潜力。根据良好的组织分布与结合预测研究最终重点验证了环黄芪皂醇分子对接显示其能稳定嵌入Plaur结合口袋并与ARG-48、GLU-91等关键残基形成相互作用图9F体外实验证实环黄芪皂醇可呈浓度依赖性地下调CT26细胞中Plaur的mRNA及蛋白表达水平图9G-I靶向定量分析确证口服XLJDD后环黄芪皂醇能够有效到达肝转移组织平均浓度达671.59 ng/g图9J。此外SPR与MST生物物理实验进一步验证了其与Plaur的特异性结合解离常数Kd为36.74 μM图9K-L。综上环黄芪皂醇是XLJDD中组织可及的Plaur结合成分且多种吸收成分可能协同介导了对Plaur通路的调控。图9.环黄芪皂醇是一种可到达靶组织、能够结合Plaur并抑制Plaur表达的活性成分研究总结本研究通过整合转录组、蛋白组、单细胞转录组测序及体内外功能实验系统阐明了仙连解毒汤(XLJDD)抑制结直肠癌肝转移(CRLM)的作用机制。研究发现XLJDD通过靶向Plaur抑制Mmp9介导的Hbegf释放阻断EGFR/ERK信号通路激活进而下调Fscn1和Cdc42ep1等细胞骨架效应蛋白的表达从而抑制肌动蛋白细胞骨架重塑和丝状伪足形成最终削弱肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。单细胞测序进一步揭示XLJDD可减少Plaur高表达的Car6⁺恶性亚群促进Ifit1⁺干扰素反应性状态并削弱恶性细胞与Thbs1⁺肿瘤相关巨噬细胞之间Spp1-Cd44介导的促转移通讯。此外本研究鉴定出环黄芪醇(Cyclogalegenin)为XLJDD中可直接结合Plaur并抑制其表达的组织可及性活性成分。体内回补实验证实Plaur过表达可显著削弱XLJDD的抗转移效果并确立了Plaur作为XLJDD发挥抗CRLM作用的关键功能靶点。这些发现为XLJDD治疗结直肠癌肝转移提供了系统的机制解析和明确的药效物质基础也为中医药现代化研究提供了“靶点清晰、成分明确”的研究范例。