一、写在前面文章****Comprehensive Single-Cell RNA Atlas of Human Laryngeal Normal, Preneoplastic, and Tumorigenic StatesIF10.2发布于2025年《Clinical Cancer Research》。喉鳞状细胞癌 LSCC 是最常见的头颈部恶性肿瘤之一大多数 LSCC 病例起源于癌前病变其中声带白斑VCL是最常见的一类癌前病变研究显示非不典型增生病例的恶性转化率为 3.7%轻度至中度不典型增生 VCL的恶性转化率为 10.1%重度不典型增生 VCL 的恶性转化率为 18.1%LSCC 超过 50% 的患者首诊时即为晚期并经常伴有淋巴转移或远处转移此外全喉切除术后失声会显著降低患者的生活质量因此早期发现以及有效预防癌前喉部病变对于改善 LSCC 的预后至关重要肿瘤微环境 TME TME 由免疫细胞、基质成分、分泌因子和细胞外基质组成与上皮细胞动态相互作用以支持肿瘤存活、侵袭和转移 在肿瘤发生发展中起关键作用TME通过诱导血管生成和代谢重编程例如瓦尔堡效应来促进肿瘤生长使肿瘤能够适应缺氧和酸性条件近年来对TME探究的理论基础支撑了免疫疗法在各种恶性肿瘤包括肺癌、卵巢癌和胰腺癌中的成功有效改善了预后但从 VCL 进展到 LSCC 的分子机制仍不确定尤其缺乏单细胞RNA测序scRNA-seq和空间转录组学的高分辨率研究如果需要单细胞数据分析教学、生信热点全文复现、自测数据个性化分析辅导、实验科研服务和常态化实验学习欢迎联系后台。二、主要内容方法结果Results 1 喉部病变中 scRNA-seq 谱的综合表征细胞聚类→注释→组分分析→HVG (高变基因)表达模式VCP组和VCL组的表达模式相对相似而LSCCP病变组的表达模式介于VCL/VCP和LSCC之间反应可能存在过渡表型共捕获318,907 个cellsLSCC 组免疫细胞比例较高→肿瘤免疫微环境丰富VCL组成纤维细胞比例相对较高内皮细胞比例增加组内的HVG表达模式一致组间存在显著差异SCENIC分析→基因和UMI计数分析→细胞间通讯分析免疫细胞群T 细胞、B 细胞和髓系细胞中 TF 表达谱相似表明存在潜在的功能相似性基因和UMI计数分析表明上皮细胞和成纤维细胞的转录活性较高而B细胞和NK细胞的活性水平较低细胞间通讯分析显示上皮细胞、T细胞和髓系细胞在相互作用强度方面表现出显著差异对肿瘤微环境TME的动态变化具有重要影响Results 2 不同喉部病变上皮细胞的异质性及微环境动力学上皮细胞亚群分析→CNV分析→KEGG上皮细胞在喉部病变中扮演着关键角色所有上皮细胞被重新聚类成35个亚群上皮细胞的比例分析显示各组之间的异质性CNV拷贝数变异分析使用VCP组的B细胞和T细胞基因组作为参考对VCL和LSCC组的所有上皮细胞亚群进行CNV分析VCL和LSCC组CNV水平升高尤其是LSCC组CNV水平更高恶性上皮细胞亚群主要富集在与细胞损伤与修复、肿瘤进展和病毒感染相关的通路此外还发现了与病毒或细菌相关的通路如EB病毒、HPV病毒和幽门螺旋杆菌GSVA分析GSVA基因集合变异分析分析LSCC样本在恶性相关通路上通常表现出较高的富集分数VCL样本整体上富集水平较低其转录特征与LSCC存在差异共有43个基因集在LSCC和VCL之间表现出显著差异某些 VCL 样本 VCL2组织学上表现为高级别上皮内瘤变表现出与 LSCC 肿瘤组织非常相似的通路富集模式表明尽管大多数VCL样本保持着与LSCC不同的转录谱但有些子集可能已经表现出表明恶性潜能升高的分子特征对上皮细胞亚簇之间通讯途径的比较分析与 LSCC 相比一些通路在VCL组现出更高的表达水平包括FN1纤维连接蛋白1、PERIOSTIN骨膜蛋白、DESMOSOME桥粒和SLURP表皮脂肪酸蛋白VCP组相比VCL组在细胞间通讯相关通路的表达上也升高包括COMPLEMENT补体系统、SLURP、ITGB2整合素β2、EGF表皮生长因子、CD99、JAM紧密连接蛋白、APP淀粉样前体蛋白提示VCL组可能具有一些潜在的恶性特征Results 3 T 细胞亚簇重编程塑造VCL 和 LSCC 的免疫抑制状态T细胞亚群分析细胞的功能作用将T细胞重新聚类分为15个亚群识别出了六种不同类型的T细胞CD4 初始T细胞naïve T cells、CD8 效应T细胞effector T cells、增殖性T细胞proliferating T cells、Th17细胞、调节性T细胞Treg、其他T细胞亚群。T细胞通讯模式VCL组和LSCC组之间T细胞亚群之间的细胞间通讯模式和信号强度在很大程度上一致在VCL组中MHC-I、CLEC和CD99通路信号传导明显更为活跃反映这些通路在VCL中的免疫反应中可能起到重要作用CD8 效应T细胞在VCL和LSCC两组中均表现出较强的信号接收强度表明CD8效应T细胞在免疫反应中的重要参与调节性T细胞在LSCC和VCL中的基因表达差异对Tregs的差异表达分析反映了LSCC组和VCL组不同的免疫调节特征LSCC中的Tregs表现出STAT家族成员和一些关键免疫抑制基因的显著上调包括IL-10、CD274PD-L1、TGFβ1表明LSCC中的Tregs倾向于免疫抑制有助于肿瘤免疫逃逸VCL来源的Tregs中STAT1的表达显著较高与免疫激活相关LSCC组Tregs富集在TNF信号通路肿瘤坏死因子信号通路、氧化磷酸化细胞的能量代谢过程、与代谢活动增强和免疫抑制功能的增强相一致进一步印证了LSCC组Tregs处于一个高度免疫抑制的状态VCL组的Tregs与免疫激活和抗病毒反应相关反映了VCL组Tregs处于癌前免疫环境尽管VCL组Tregs更倾向于免疫激活但其仍包含一些与免疫抑制相关的基因表明VCL中的Tregs已朝着免疫调节方向发生早期功能转变Results 4 Bregs在VCL和LSCC中的异质性和免疫抑制作用B细胞亚群分析B细胞是唯一能够产生抗体的免疫细胞在适应性免疫反应中起着至关重要的作用B细胞被重聚类为13个不同的亚群包括记忆B细胞memory B cells、初始B细胞naïve B cells、生发中心B细胞germinal center B cells、调节性B细胞Breg、浆细胞plasma cells、其他B细胞亚群这些亚群在四种组织类型中分布不同B细胞在良性和恶性喉部病变中具有异质性除了传统的B细胞亚群外还识别出了调节性B细胞BregBreg在VCL和LSCC中的占比更高KEGG分析显示在SC0和SC6亚群中核糖体通路显著富集表明这些Breg具有增强的抗体分泌活性。另外 LSCC和VCL中的SC8 Breg亚群在PD-L1信号通路中富集显著表明这些Breg可能介导免疫抑制的TME形成Bregs的基因表达谱LSCC来源的Bregs中与免疫抑制相关的基因显著上调包括STAT3 和 STAT4、TGFB1、PRDM1转录因子参与免疫抑制、IRF4免疫相关转录因子说明LSCC来源的Bregs呈现出更强的免疫抑制表型可能在TME的重塑中发挥作用与线粒体代谢相关的基因MT-CO1和MT-CO2在LSCC Bregs中也显著上调提示这些细胞可能具有更强的代谢活动KEGGVCL来源的Bregs则更多表达与抗原呈递和免疫激活相关的基因表明可能在促进免疫反应和维持免疫调节平衡中发挥作用LSCC来源的Bregs表现出活跃的核糖体活动VCL来源的Bregs则主要参与抗病毒免疫过程细胞间通讯LSCC来源的Bregs表现出增强的传入信号传导活动表明LSCC中的Bregs不仅参与免疫抑制还可能通过信号传导与其他细胞进行更复杂的相互作用Results 5 VCL和LSCC中的髓系细胞异质性和信号动力学髓系细胞亚群分析髓系细胞信号动态LSCC中髓系细胞的传出和传入信号活动都更加强烈和尤其是在中性粒细胞和巨噬细胞表明它们在TME中可能参与了肿瘤的免疫反应和细胞间通讯LSCC中多个关键炎症和趋化性信号通路显著富集包括CXCL趋化因子、CCL细胞因子、TNF肿瘤坏死因子、IL-6白细胞介素6反映了促炎的TME且细胞之间的通讯活动增强可能促进肿瘤细胞的侵袭和免疫逃逸VCL的信号活动相对较低其肿瘤微环境的免疫活性较弱富集较多的是与细胞外基质重塑和组织修复相关的信号通路如FN1纤维连接蛋白、ITGB2整合素β2、表明VCL的免疫微环境更注重于修复和组织重建而非炎症反应Results 6 scRNA-seq 与空间转录组学联合揭示 VCL 和 LSCC 中的细胞异质性和免疫抑制微环境肿瘤组织表现出更高的复杂性和细胞异质性其TME更加活跃LSCC中富含浆细胞的空间点占比较高约占所有空间点的10%而其他组织类型中浆细胞的比例通常不到1%与之前的scRNA-seq分析结果一致作为体液免疫的核心效应细胞可能在LSCC的免疫微环境重塑中发挥重要作用在LSCC的免疫细胞聚集区观察到以Bregs和Tregs为主的空间点进一步证实了LSCC免疫微环境主要具有免疫抑制特性VCL中的细胞间相互作用VCL中细胞间相互作用的空间映射较不明显可能是FFPE样本的大小或切片伪影限制相互作用主要局限于上皮细胞和成纤维细胞显示出其免疫微环境较为简单性LSCC中的细胞间相互作用有更显著的细胞间通讯特别是在上皮细胞、浆细胞、Tregs和Bregs之间表明LSCC的TME中免疫反应和细胞间通讯更为活跃Treg标记基因的空间共表达分析经典Treg标记基因FOXP3、IL2RA和CTLA4与免疫抑制相关基因CD274、IL10、TGFB1、STAT2和STAT4的空间共表达尽管Tregs在VCL和LSCC中均参与免疫调节LSCC中的Tregs倾向于表达更多的免疫抑制基因LSCC中的免疫抑制Tregs显示出更强的免疫抑制特性有助于肿瘤的免疫逃逸VCL中免疫抑制Tregs的数量相对较少且空间信号较弱可能反映了在病变进展早期免疫抑制作用的初步建立三、总结与展望结论上皮细胞异质性VCL中存在具有恶性潜能的上述皮亚群其CNV水平介于VCP与LSCC之间提示其为癌变过渡状态免疫抑制微环境VCL和LSCC均存在免疫抑制特征但LSCC中Tregs和Bregs的免疫抑制功能更强且伴随STAT等信号通路的激活细胞间通讯网络LSCC中细胞间信号交流较为复杂涉及多种炎症和趋化因子通路CXCL、CCL、TNF空间结构通过空间转录组学证实LSCC中免疫抑制细胞Tregs、Bregs在肿瘤区域富集并呈现与免疫逃逸相关的基因表达模式创新点1. 结合scRNA-seq与空间转录组学从细胞类型、基因表达、空间分布三个维度分析疾病进展2. 系统揭示了T细胞、B细胞、髓系细胞等在癌变过程中的功能重塑与免疫抑制机制。3.临床转化潜力识别出VCL中具有恶性潜能的细胞亚群和免疫特征为早期诊断和干预提供了分子靶点技术手段和方法单细胞RNA测序scRNA-seq平台10X分析流程Cell Ranger → Seurat → Harmony批次校正 → t-SNE/UMAP聚类 → 细胞类型注释空间转录组学平台10X生物信息学分析CNV推断上皮细胞恶性程度、SCENIC转录因子活性、GSVA评估通路富集程度、CellChat分析细胞间配体-受体互作网络、KEGG/GO功能富集分析局限性1. 缺少功能验证可通过体外或体内实验验证关键基因如SREBF2、BACH1在喉癌进展中的作用2. 可联合多组学分析结合蛋白质组、表观基因组等展望可开发基于免疫特征或上皮亚群的早期诊断标志物深入探究针对Tregs/Bregs或髓系细胞的免疫治疗策略功能实验验证靶向STAT、CXCL/CCL等信号通路的临床应用潜能