一、概述与基本原理凝胶迁移实验又称电泳迁移率实验Electrophoretic Mobility Shift AssayEMSA是研究核酸结合蛋白与特定核酸序列相互作用的核心技术之一兼具定性与定量分析功能。该方法最初应用于DNA结合蛋白的研究目前也已广泛应用于RNA结合蛋白与RNA序列互作的解析。其基本原理为将纯化或部分纯化的蛋白或细胞抽提液与经同位素如³²P标记的DNA或RNA探针共同孵育随后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于蛋白-核酸复合物的分子量大于游离探针其在凝胶中的迁移速率显著降低从而通过放射自显影实现复合物与游离探针的可视化分离。根据蛋白来源及实验目的探针可为双链或单链形式样本可采用核抽提物或胞质抽提物。在竞争实验中通过加入特异性或非特异性未标记探针可根据复合物条带的强度变化判断结合的特异性。二、主要应用目的① 鉴定特定转录因子及其识别的顺式作用元件② 评估蛋白质与DNA序列结合的亲和力与特异性③ 分析探针序列突变对蛋白结合能力的影响④ 辅助DNA足印迹DNA-footprinting实验定位蛋白结合的关键碱基区域。三、操作流程本实验采用Thermo FisherPierce公司EMSA试剂盒主要操作步骤如下一探针标记与处理① 冰上解冻标记试剂盒各组分TdT酶除外② 使用1×TdT反应缓冲液将TdT酶稀释至工作浓度2 U/μL③ 按试剂盒说明书配制50 μL标记反应体系于37 °C孵育30 min④ 加入2.5 μL 0.2 M EDTA终止标记反应⑤ 加入50 μL氯仿-异戊醇24:1抽提去除TdT酶振荡后离心取上层水相⑥ 评估探针标记效率⑦ 与互补链退火退火产物可直接用于EMSA实验或于-20 °C冻存备用。二EMSA结合与电泳分离① 制备4%–6%非变性聚丙烯酰胺凝胶100 V电压下预电泳② 按实验设计配制20 μL结合反应体系依次加入各组分③ 加样后以60 V电压电泳至溴酚蓝指示带迁移至凝胶约2/3处停止。三转膜与化学发光检测① 采用半干转膜仪380 mA恒流转膜1 h将核酸转移至尼龙膜② 膜封闭室温下于Blocking Buffer中轻摇孵育15 min③ 抗体孵育更换为含偶联物的Blocking Buffer工作液室温轻摇15 min④ 洗涤用1×Washing Buffer洗涤膜4次每次5 min室温轻摇⑤ 平衡将膜转移至Substrate Equilibration Buffer中室温轻摇5 min⑥ 显色避光条件下配制Substrate Working Solution将膜浸入孵育5 min⑦ 取出膜吸去多余液体用保鲜膜包裹避免褶皱置于暗室内进行X光片曝光及记录结果。