小鼠新生表皮角质形成细胞(NEK)原代细胞的分离简介皮肤是人体面积最大的器官由表皮和真皮构成以皮下组织与深层组织相连。表皮是皮肤的浅层分为厚皮和薄皮。厚皮自下而上分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。新生角质形成细胞 Neonatal epidermal keratinocytesNEK来自新生小鼠的表皮是其的主要构成细胞占表皮细胞的90%以上。表皮由基底层到角质层的结构变化反映了角质形成细胞增殖、迁移、分化等新陈代谢过程。成纤维细胞是真皮组织的主要组成成分位于皮肤的真皮网织层可分泌细胞外基质构成细胞骨架及多种细胞因子参与瘢痕形成、皮肤损伤的修复和再生对抗皮肤衰老。中性蛋白酶-胰蛋白酶混合消化法二、材料1、实验动物: 出生1-3天的Balb/c 乳鼠雌雄不限2、组织来源背部皮肤3、手术器材手术剪镊、解剖镊、眼科剪镊、手术刀4、消化酶中性蛋白酶麦克林Cat#: D915910、0.25%胰酶翊圣Cat#: 40101ES255、培养基K-SFM 培养基GibcoCat#:17005042三、实验步骤1、取材①取5-6只出生72小时内的balb/c乳鼠断颈处死后置于75%酒精中消毒2次每次1-2分钟。②移入超净工作台内用含有2%双抗的PBS浸泡洗去除大鼠皮肤表面残余酒精取乳鼠背部皮肤。③用手术剪和手术镊仔细的去除皮下组织主要是脂肪和肌肉、血管等组织尽可能的去除干净用含2%双抗的PBS清洗2次。 将其修剪成约5mm×10mm正方形小块真皮和表皮的分离①将取得的皮肤样品平铺置于另一个干净的培养皿中表皮面朝上加入10ml的2.5mg/ml0.25%的中性蛋白酶Dispase(用不含血清的DMEM 稀释)使表皮向上浸没入酶液中4℃过夜12-16小时左右。②用手术镊将表皮轻轻从真皮上撕下表皮向上用手术镊压住组织边缘另一手术镊夹住表皮将其从真皮上撕下将分离的表皮置于新的培养皿中。组织消化①将分离后的表皮用手术刀充分切碎加入2ml 的0.25%胰酶于37℃条件下孵育20~25min消化过程中每5分钟用移液枪轻轻吹打促进细胞脱落。②待大量细胞脱落溶液变浑浊加入适量的FBS终止消化经200目筛网过滤后滤液以1000rpm离心5min去掉上清细胞沉淀用K-SFM培养基进行重悬接种于6孔板或者T25培养瓶中置于培养箱中进行培养。③角质形成细胞培养24~48h后首次换液(期间镜下观察到细胞大量贴壁待细胞长至80-90%后可进行传代。图.云克隆分离的小鼠皮肤表皮组织图.云克隆分离的小鼠皮肤真皮组织各阶段的角质形成细胞照片图.云克隆小鼠角质形成细胞形态五、小鼠新生表皮角质形成细胞的鉴定常用鉴定方法CK-18和ZO-1免疫荧光染色图.云克隆小鼠角质形成细胞荧光鉴定CK-18图.云克隆小鼠角质形成细胞荧光鉴定CK-19武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠兔犬猫山羊豚鼠等560多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。