酵母基因功能验证伯远生物酵母基因功能验证伯远生物是国家级专精特新小巨人企业农业农村部生物育种重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上是国内最大植物功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含清北、复旦、武大、华科等知名高校及所有农业类科研院所服务头部种业公司客户300余家涉及四十多个物种含水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆五大主粮以及禾本科高粱、甘蔗葫芦科黄瓜、西甜瓜茄科番茄、辣椒与十字花科等100多个品种的50多个性状含抗虫抗病、抗除草剂、品质提升、株型改良等各类仪器设备投资超1个亿高标准恒温繁育基地200亩案例展示案例展示1、total RNA提取结果2、mRNA纯化3、初级文库片段长度与阳性率验证初级文库长度范围300-3000 bp平均长度1200 bp阳性率100%4、初级文库库容量鉴定库容量1075、次级文库片段长度与阳性率验证次级文库长度范围650-3000 bp平均长度1200 bp阳性率100%6、次级文库库容量鉴定库容量107背景说明背景说明为了研究某种核酸或蛋白与哪些蛋白有相互作用酵母文库就诞生了。所谓的“库”顾名思义就是“仓库”也就是包含所有基因的一个大仓库。我们通过提取被研究物种的总RNA再分离出mRNA通过逆转录得到cDNA之后我们将这些cDNA与AD载体连接得到了一个AD文库。理论上这样的酵母库能够表达被研究物种的所有蛋白。后期只需要把待研究的目的基因构建到诱饵载体上就能和这个酵母文库进行筛库实验。我司酵母建库的方法有Gateway和SMART技术其中以Gateway技术为主。图 核体系酵母文库构建简要流程。服务流程服务流程需求沟通及确认——材料准备——文库构建——数据整理——实验报告服务内容及说明服务内容及说明我司酵母建库的方法有Gateway技术和SMART技术其中以Gateway技术为主。1文库构建技术方法基于Gateway技术进行酵母文库构建原理基于SMART技术进行酵母文库构建原理2不同酵母建库技术的比较3不同酵母建库技术交付标准及交付结果我司酵母建库的方法有Gateway技术和SMART技术其中以Gateway技术为主以下主要介绍Gateway技术。Gateway技术优势1.初始RNA量大大大提高cDNA基因覆盖度2.需mRNA分离降低后期其他类型RNA对反转录的干扰3.无需进行多循环的PCR扩增放大大大降低基因的冗余率4.体外Gateway重组后电转化大肠杆菌更稳定效率更高而不是原始的以及线性化载体在大肠杆菌体内重组。Gateway建库产品优势1.严谨的实验过程2.对得到实验结果精益求精3.严格的质控文库质量可靠4.完善的售后服务。Gateway建库主要实验步骤及周期材料要求针对每个文库客户需提供至少能提取500 μg总RNA的新鲜样本尽量多准备些暂不接受RNA样本。具体要求如下酵母建库样品接收标准注1.对于样品客户可根据自己的实验目的选取材料的部位和时期可以是某一时期的某一部位样品也可以是某一时期的整个植株样品具体需要依据实验目的而定一般不同处理条件下的材料需要分别建库如果客户要求混合建库也是可以的。2.我司酵母建库目前一般默认Gateway方法当然如果提供的实验材料有限不足以用Gateway技术时我司还有SMART技术建库可供选择。共享文库目前伯远生物已完成数千个各类文库构建拥有丰富的文库构建经验。如果客户有酵母筛库业务相关需求的话我司可以免费为您提供相关物种的酵母文库进行筛库无需重复构建提供一站式服务。因为种类比较多就没有一一列举出来如果客户研究的是其它物种的欢迎打电话400-027-0273进行咨询哦部分共享酵母文库信息客户下单及项目信息填写1.客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行提交2.提交项目所需要的具体信息包括1已知的材料品种与组织信息2文库构建类型核文库/膜文库3如果有特殊要求请在备注中注明。3.文库构建材料用于提取total RNA的组织材料尽量多准备些暂不接受RNA样本实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看地址。实验结题后实验报告检测结果可在线查看或打印并永久保留。实验流程实验流程一、实验技术流程1、Total RNA的提取1取适量组织样品在预冷的研钵中用液氮研成粉末然后转入RNase free离心管中2加入20mL的CTAB试剂加入600μL巯基乙醇振荡混匀65℃静置30min充分裂解每10min震荡一次3加入4mL的氯仿剧烈震荡15s室温静置5-10min48000×g4℃离心15-20min5取上清至新RNase free离心管中加入1/3体积5M氯化锂颠倒混匀4℃静置过夜612000×g4℃离心15min7弃上清加入5mL的75%乙醇RNase free洗涤沉淀12000×g高速冷冻离心 5min8重复步骤7一次9弃上清超净工作台中干燥RNA沉淀然后溶解于适量DEPC水中。2、mRNA分离1取上一步骤中提取的total RNA, 冰上融化放置2取500μL Binding buffer B6与RNA等体积于65℃水浴预热3小心用移液器轻轻混匀Fasttrack MAG beads, 吸取200μL beads到1.5mL RNase free离心管中4将含有MAG beads的离心管放置在磁座上静置1min用移液器吸去上清避免碰触MAG beads5将离心管从磁座上取下马上加入500μL Wash buffer W7, 小心混匀6将离心管放置在磁座上静置1min用移液器吸去上清避免碰触MAG beads7重复步骤5- 6一次8将离心管从磁座上取下加入预热的Binding buffer B6和total RNA小心混匀后65℃水浴孵育5min9室温旋转颠倒混匀样品离心管10min10将样品离心管放置在磁座上静置1min用移液器吸去上清11重复步骤5- 6四次12将洗涤过四次的Beads管从磁座上取下加200μL DEPC水小心混匀37℃水浴2min13将离心管放置在磁座上静置1min小心吸取上清至一个新的1.5mL离心管中RNase free14重新在Beads管中加入100μL DEPC水从磁座上取下小心混匀后放置到磁座上15静置1min后小心吸取上清置于步骤13的离心管中将两次洗脱溶液合并即样品的mRNA。3、cDNA初级文库构建1片段和接头设计参考参考《GATEWAY™ Cloning Technology》进行设计2扩增引物设计3cDNA第一链的合成4cDNA第二链的合成5cDNA adapter的制备6cDNA与attB1重组接头连接三份接头各连一份7cDNA分级分离8BP重组9电转化大肠杆菌DH10B10文库克隆检测。4、pGADT7酵母文库的构建1初级文库的质粒抽提2文库质粒重组3酵母文库质量鉴定。a、库容量的鉴定b、重组率c、插入片段长度鉴定。二、实验重难点相比于SMART建库Gateway建库对RNA起始量要求较高。三、与其他同类型实验相比优势与劣势酵母文库可以多次使用同一物种的酵母文库可以用于不同的转基因筛选。不过对于亚细胞定位尚不明确的诱饵蛋白需要明确其具体定位后才能选择合适的酵母文库。四、我司该实验业务优势1、初始RNA量大大大提高cDNA基因覆盖度2、分离mRNA为模板可避免rRNA或残留基因组对一链合成的影响3、mRNA反转录可获得完整的基因信息避免冗余避免了PCR扩增可能产生的基因偏好性4、Gateway重组法的高效性较其它重组法优势非常明显5、Gateway文库可以重复使用次数是SMART技术10-20倍6、体外gateway重组后电转化大肠杆菌更稳定效率更高而不是原始的以及线性化载体在大肠杆菌体内重组。五、常见问题答疑1、对于膜体系酵母文库和核体系酵母文库该如何选择A对于亚细胞定位显示定位在细胞核的蛋白选择核体系文库对于定位在细胞膜的蛋白则选择膜体系文库对于定位在细胞质的蛋白可以选择核体系文库或膜体系文库。2、膜体系酵母文库和核体系酵母文库在构建上有什么区别A两者在初级文库构建上都是通过BP重组至pDONR222载体并电转化DH10B感受态不过在次级文库构建上核体系文库是通过LR重组至pGADT7-GW载体并电转化DH10B感受态而膜体系文库是通过LR重组至pPR3-N载体并电转化DH10B感受态。3、有关总RNA的吸光度各自代表什么A260nm、340nm、230nm、280nm吸光度分别代表了核酸、背景溶液浑浊度、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280体现了提取的RNA中蛋白质等有机物的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD280比值应该在1.8到2.2之间。如OD260/OD280小于1.8则说明RNA中蛋白质等有机物的污染较多如OD260/OD280大于2.2则说明RNA已经降解成了单核苷酸。OD260/OD230则体现了提取的RNA中盐离子或多糖的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD230比值应该在2.0左右。如OD260/OD230的比值小于1.0则说明RNA中仍残留大量多糖或盐离子污染。多糖的污染会影响OD260的吸收从而导致RNA的浓度测定不准。残留的盐离子则可通过75%乙醇洗涤去除。酵母基因功能验证通常以敲除/敲低、异源功能互补、过表达和互作验证为主最常见的是先看表型变化再用回补或互作实验把功能证实起来。常用验证路线基因敲除后看表型构建单基因缺失株观察生长速度、细胞形态、营养缺陷、胁迫耐受或代谢变化。酵母基因功能验证异源功能互补把候选基因导入已知缺陷的酵母突变株中看能否恢复生长或其他表型这是功能验证里证据很强的一类方法。过表达验证提高目标基因表达量观察是否增强、削弱或改变相关表型。机制补充实验酵母双杂交、单杂交、膜蛋白互补或荧光互补等可用于验证蛋白互作或蛋白-DNA调控关系。酵母基因功能验证典型实验流程克隆目标基因构建敲除、过表达或互补载体。酵母基因功能验证转化酵母并筛选阳性克隆通常结合抗性筛选和PCR/测序确认。酵母基因功能验证做表型测试包括平板生长、液体生长曲线、温度/盐/氧化胁迫处理或营养缺陷恢复实验。若要进一步证明机制再做双杂交、单杂交或相关报告系统。酵母基因功能验证结果怎么判断敲除后表型减弱或丢失提示该基因参与该生物过程。酵母基因功能验证互补后表型恢复说明候选基因功能与已知基因一致或高度相关。互作/调控实验阳性只能证明存在相互作用或调控关系最好结合功能表型一起解读。常见应用场景营养代谢和离子稳态相关基因功能研究。酵母基因功能验证细胞周期、细胞形态和应激响应相关基因验证。转录调控网络、蛋白互作与上游调控元件研究。