腺相关病毒载体构建伯远生物腺相关病毒载体伯远生物是国家级专精特新小巨人企业国家级重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上作为功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含协和、同济、华西、湘雅、中山、军事医学院等顶尖医学研究机构各类仪器设备投资超1个亿案例展示文献示例案例一AAV2感染肝脏图 小鼠肝脏中AAV2介导的转基因表达Wang L, et al. 2010。案例二AAV感染心脏图 五种AAV血清型对心肌细胞特异性基因递送的效率比较Prasad KM,et al. 2011。我司AAV2感染细胞效率参考文献Hudry E, Vandenberghe LH. Therapeutic AAV Gene Transfer to the Nervous System: A Clinical Reality.Neuron. 2019;101(5):839-862.Prasad KM, Xu Y, Yang Z, Acton ST, French BA. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.Gene Ther.2011;18(1):43-52.Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-378.Wang L, Wang H, Bell P, et al. Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models.Mol Ther.2010;18(1):118-125.我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达腺相关病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联背景说明背景说明在AAV研究的前15-20年中AAV的几个重要方面被表征包括其基因组构型和组成、DNA复制和转录、感染潜伏期和病毒粒子组装。现如今重组AAVrAAV已成为体内基因治疗递送的主要平台。第一种rAAV基因治疗产品是uniQure公司的alipogene tiparvovec(Glybera)于2012年被欧洲药品管理局EMA批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症2018年FDA批准了voretigene neparvovec-rzyl(Luxturna)这是第一个获得美国许可的rAAV基因疗法。图 50年AAV时间线Wang D, et al.2019。原理简介AAV属微小病毒科parvovirus为无包膜的单链线状DNA病毒目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。AAV由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和约4.7kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含VP1、VP2和VP3三类亚基共60种拷贝比例为1:1:10VP1:VP2:VP3。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列ITR其末端主要用作病毒复制起点和包装信号其中Rep基因编码4个重叠的多功能蛋白并以其分子量命名为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制Cap基因编码VP1、VP2、VP3在AAV病毒整合、复制和装配中其重要作用编码组装活化蛋白AAP的第三个基因在不同开放阅读框ORF中的cap编码序列内编码并且可促进病毒粒子组装。图 AAV基因组结构Hudry et al. 2019。AAV基因组可以整合到人类细胞中称为AAVS1的基因组基因座中以建立潜伏期。由于AAV具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点已被广泛应用于基础研究和临床试验中并且AAV载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。图 rAAV转导通路Wang D, et al.2019。目前AAV有多种血清型不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的AAV载体。表 不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性各病毒载体生物学特性比较表 不同病毒的生物学特性比较我司载体简介我司AAV血清型种类齐全可提供AAV1-AAV9以及DJ、DJ/8、Rh10等12种血清型而且还可包装双链AAVscAAV。我司AAV载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、RK1、EF1a、GFAP等多种启动子可供选择而且还有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多种荧光标记蛋白可供选择同时可以提供诱导型AAV病毒的包装如Tet-On系统等。我司原始细胞腺相关病毒包装载体列表可根据不同的需求选择不同的载体插入不同的位置图 原始商品化腺相关病毒载体服务流程服务流程客户在线下单——订单/实验材料确认——目的基因获取——AAV载体质粒构建及测序——载体质粒、辅助质粒、包装质粒共转染293T细胞——AAV病毒收集——病毒浓缩和纯化——AAV质检包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等——可选后续感染目的细胞及相关实验我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达腺相关病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联服务内容及说明服务内容及说明适用范围可用于多种疾病的基因治疗研究包括体内、体外实验同时作为一种有特点的基因转移载体广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。客户下单及项目信息填写在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录请客户按照页面提示填写基因名称注明过表达或干扰、基因ID、序列等信息细胞可选自行提供或我司提供。实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看网址。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看或打印并永久保留。实验周期致电详询实验交付内容1、所有实验的原始数据包括实验过程、实验试剂与设备等2、重组载体的全序列信息和注释信息3、重组载体的酶切图谱4、重组载体测序结果5、引物序列6、病毒质控鉴定报告与结果分析包含滴度鉴定、BCA检测、支原体检测等可选7、1mL高滴度AAV载体不低于1011GC/mL8、0.1mL阴性对照病毒不低于1011GC/mL。AAV的优点1、安全性高。迄今从未发现野生型AAV对人体致病重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件进一步保证了安全性2、免疫原性低。当AAV用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除对动物实验极有帮助3、宿主范围广。几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可用AAV感染4、表达稳定、持续时间长。可在宿主细胞中形成附加体episome存在于细胞核中在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达5个月以上5、扩散性强。rAAV具有远高于AdV和LVs的扩散性可以穿透血脑屏障是最理想的神经元和胶质细胞感染工具6、物理性质稳定。可使用冰袋运输在60℃不被灭活能抗氯仿7、特异性强。rAAV有十数种常用的血清型不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力。会有影响而且影响大小取决于你的后续用途。如果是做过表达、敲低后看表型标签和筛选元件不是必须但它们会明显影响后续验证、富集和纯化的便利性如果你后面要做稳定建系、单克隆筛选或蛋白检测完全不加会让流程更难控。不加标签的影响腺相关病毒载体构建优点构建更简单载体更小理论上对AAV这类有装载上不加标签的影响优点构建更简单载体更小理论上对AAV这类有装载上限的系统更友好。缺点后续很难快速区分是否表达成功通常只能依赖功能实验、qPCR或非标签抗体检测验证成本更高。如果目的基因本身没有好用抗体不加标签会让WB、IP、IF这类实验更麻烦。不加筛选元件的影响优点表达盒更短更适合AAV这种对插入长度敏感的体系。缺点后期无法靠抗生素快速富集阳性细胞感染后只能做群体观察或依赖荧光分选工作量会大很多。对稳转细胞株来说不加筛选元件往往意味着很难从混合群体里稳定拿到高纯度阳性细胞。什么时候可以不加做AAV体内表达且插入片段已经比较大时可以优先保留目的基因本体尽量压缩表达盒。腺相关病毒载体构建只看功能表型不需要做蛋白纯化、免疫沉淀或克隆追踪时可以不加标签。目标基因本身已有可靠抗体且你不打算做筛选分离时也可以不加标签或筛选元件。什么时候建议加腺相关病毒载体构建要做稳转细胞株强烈建议保留筛选标记不然后面很难富集。腺相关病毒载体构建腺相关病毒载体构建要做蛋白检测、纯化或共免疫沉淀建议加小标签比如常见的检测标签或纯化标签。目的基因抗体不好用或者你担心内源信号干扰时加标签通常更稳妥。腺相关病毒载体构建对你这个场景的建议腺相关病毒载体构建如果你现在是做AAV载体构建我的建议是腺相关病毒载体构建体内表达/空间有限优先保留目的基因本体能不加就不加尤其是大标签和冗长筛选盒。体外细胞实验/稳定表达尽量加一个小型标签或筛选元件至少保留后续验证手段。腺相关病毒载体构建如果必须二选一做AAV时通常优先保留“能表达成功”而不是“信息最全”因为载量限制更现实。