构建bifc载体伯远生物构建bifc载伯远生物是国家级专精特新小巨人企业农业农村部生物育种重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上是国内最大植物功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含清北、复旦、武大、华科等知名高校及所有农业类科研院所服务头部种业公司客户300余家涉及四十多个物种含水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆五大主粮以及禾本科高粱、甘蔗葫芦科黄瓜、西甜瓜茄科番茄、辣椒与十字花科等100多个品种的50多个性状含抗虫抗病、抗除草剂、品质提升、株型改良等各类仪器设备投资超1个亿高标准恒温繁育基地200亩案例展示伯远生物是国家级专精特新“小巨人”企业在载体构建领域具备全谱系技术整合能力可将载体设计与基因编辑、蛋白表达、功能验证等实验打包形成完整机制研究闭环特别适合功能研究与高分文章发表需求。公司依托全链条平台能力提供植物、动物及微生物表达载体构建覆盖CRISPR编辑、RNA干扰、报告基因等多种应用场景实现从序列设计到质粒交付的一站式服务。核心优势◆全谱系载体平台覆盖植物表达、动物表达、微生物表达、基因编辑、报告基因、RNA干扰六大体系满足多场景研究需求◆高效构建能力支持传统酶切及多种克隆策略兼容单基因到多片段最多10片段构建从序列到质粒最快3天交付◆多样启动子体系提供35S、Ubiquitin、Actin等组成型启动子以及组织特异与诱导型启动子乙醇、地塞米松、热激等灵活适配不同实验设计◆丰富标签与表达系统支持Flag、HA、Myc、His、GST、GFP、mCherry等20余种标签融合兼容哺乳动物、昆虫、酵母等表达体系◆基因编辑全套方案提供CRISPR/Cas9、Cas12a、碱基编辑、先导编辑载体支持多gRNA串联表达编辑效率行业领先◆RNA干扰体系完善覆盖shRNA与amiRNA双体系支持Tet-On诱导表达满足条件性沉默需求◆即用型报告系统提供LUC、GFP、GUS、YFP等成熟报告载体实现快速功能验证◆严格质控体系默认包含Sanger测序、酶切验证、转化验证交付质粒图谱、测序报告及浓度检测结果确保结果可靠服务周期常规载体构建3–7 个工作日 多片段/复杂载体构建5–10 个工作日支持加急适合场景基因功能研究过表达、敲除、敲低等多策略载体构建 基因编辑研究CRISPR/Cas 系统构建及多位点编辑 蛋白表达研究标签融合表达及功能蛋白制备 报告基因实验启动子活性、信号通路研究 机制研究/高分文章与蛋白互作、表达分析等实验联动形成完整证据链 科研课题/农业/生物医药覆盖多领域应用需求真实案例平台年载体构建量超过 6 万个累计服务课题组逾 1 万个依托标准化构建体系与高通量能力确保项目高成功率与稳定交付广泛应用于基础科研与产业研发。售后保障质量问题免费重构 构建失败免费优化并重做 工作日 4 小时快速响应伯远生物凭借全谱系载体构建平台、高效克隆能力、完善质控体系及全链条机制研究闭环为分子克隆与基因功能研究提供高效率、高成功率的一站式解决方案是科研人员与企业客户开展载体工程研究的优选合作伙伴。文献举例图 双分子荧光互补实验BiFC。绿点表示蛋白质-蛋白质相互作用红点表示细胞核黄色或棕色点表示细胞核中的蛋白质-蛋白质相互作用箭头表示细胞核。空YFPn或YFPc加基因融合载体为阴性对照。参考文献Wang WQ, Wang J, Wu YY, et al. Genome-wide analysis of coding and non-coding RNA reveals a conserved miR164-NAC regulatory pathway for fruit ripening.New Phytol. 2020;225(4):1618-1634.背景说明背景说明双分子荧光互补Bimo-lecular fluorescence complementation简称BiFC该技术巧妙地将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段N-fragment、C-fragment再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近就会使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近重新形成活性的荧光基团而发出荧光。我司的BiFC系统为改良的BiFC系统降低了假阳性出现的概率增加了阳性对照系统除了能够证明相互作用也能证明其不相互作用。图 原始载体pSm35s-cYFP图 原始载体pSm35s-nYFP服务流程服务流程客户在线下单—订单/实验材料确认—CloneCAD实验设计—载体构建服务内容及说明服务内容及说明适用场景1、验证蛋白质之间是否存在相互作用可与酵母双杂、Co-IP等实验结果相互验证2、对细胞内蛋白相互作用的位置进行研究。优势特点1、采用我司已被授权的国际PCT专利技术专利号US 10,144,936 B2来进行载体的构建且该组装为无缝组装2、载体资源丰富支持个性化定制载体3、实验结果可靠、图片美观4、可与我司BiFC实验进行衔接整个实验可以畅通且快速地完成。实验周期5-10个工作日样品接收标准客户下单及项目信息填写在我司官网/进行注册或登录请客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、项目所需要的具体信息价格由系统自动计算。实验信息在实验开始、结题关键节点系统会自动发送短信到申请人手机进行告知实验过程中客户可以随时登录客户管理系统查看项目实时进展情况。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看并永久保留。重组载体在实验结束后免费为客户保存半年后销毁。客户邮寄的模板在实验结束后免费保存1个月后销毁。结题标准目的片段构建至目的载体上俗称“构建成功”。实验交付内容1、重组载体的全序列信息和注释信息2、重组载体的酶切图谱3、重组载体的测序结果4、重组载体一份质粒、一份大肠杆菌菌液25%甘油菌。5、如果需要转化农杆菌12份农杆菌菌液25%甘油菌2农杆菌的检测图片。构建BiFC载体的核心思路是把目标蛋白分别融合到荧光蛋白的N端片段和C端片段上让两种融合蛋白在细胞内共表达如果目标蛋白发生互作荧光蛋白片段就会靠近并重构发光。构建bifc载体设计原则先确定载体体系植物体系常见有pSPYNE/pSPYCE、pCE-BiFC、pBiFC-VN/VC等动物或通用体系也有对应的YFP/GFP分割载体。决定融合方向目标蛋白可接在荧光蛋白片段的N端或C端具体取决于蛋白结构、亚细胞定位和是否影响互作界面。加linker更稳妥在目标蛋白与荧光片段之间加短linker常能减少空间位阻提高融合蛋白正确折叠和互作概率。构建bifc载体保持阅读框正确插入片段必须与载体ORF同框否则不会得到正确融合蛋白。构建流程选择合适的BiFC骨架载体并确认启动子、标签和筛选标记。设计目标基因扩增引物去掉或保留终止密码子要根据“是否与荧光片段融合”来决定。通过酶切连接、Gibson或无缝克隆把目标基因分别插入N片段和C片段载体中。测序确认插入方向、序列准确性和阅读框正确。构建bifc载体构建bifc载体将两个重组载体共转化到原生质体、烟草叶片、酵母或哺乳动物细胞中观察荧光。关键注意点构建bifc载体必须做阴性对照例如空载体组合或不相关蛋白组合用来排除片段自发复性背景。构建bifc载体建议做双向验证即目标蛋白A/B互换接到N片段和C片段上因为片段位置可能影响结果。构建bifc载体先看亚细胞定位如果融合后蛋白定位异常BiFC结果很可能失真。构建bifc载体避免过强表达过表达可能造成假阳性或非生理性聚集。常见构建方案构建bifc载体植物常用pSPYNE/pSPYCE、pCE-BiFC、pX-NYFP/pNYFP-X。哺乳动物常用pBiFC-VN173/VC155、pIB-YN155/VC156等。如果做转录因子或膜蛋白最好先测试N端融合还是C端融合更合适。一句实操版把目标基因分别克隆进荧光蛋白分裂载体的两个半片段中测序无误后共表达若两蛋白互作则荧光蛋白恢复荧光显微镜下即可看到信号。