一、写在前面文章《Single cell analysis in head and neck cancer reveals potential immune evasion mechanisms during early metastasis》单细胞分析揭示头颈部癌早期转移过程中潜在的免疫逃逸机制该文献发表于杂志《Nature Communications》2023 年影响因子为17.7。头颈部鳞状细胞癌HNSCC是常见的恶性实体瘤淋巴转移是其预后不良的关键标志通常先于远处转移发生严重影响患者生存率。目前临床针对HNSCC淋巴转移患者以手术联合放疗的根治性治疗为主核心目标是清除具有转移潜能的肿瘤克隆但疗效仍受限于对转移机制的认知不足。 肿瘤转移是一个连续的表型过程涵盖从原发灶局部浸润、循环肿瘤细胞形成到淋巴结微转移、大体转移及远处扩散等阶段。传统观点认为上皮-间质转化EMT是肿瘤淋巴转移的必要前提但 bulk测序分析显示HNSCC中EMT并非淋巴转移的必需条件且EMT本身呈谱系化特征肿瘤细胞具有显著的表型可塑性这可能是临床转移表现异质性的重要原因。此外传统检测方法分辨率有限难以识别具有真实转移潜能的稀有肿瘤亚克隆也无法精准定位可干预的转移相关通路导致抗转移治疗进展缓慢。单细胞技术的发展为解决上述问题提供了新工具既能识别稀有的高转移潜能肿瘤亚群又能解析肿瘤微环境中细胞间的动态互作。同时随着免疫检查点阻断疗法在肿瘤治疗中的应用免疫系统在转移级联中的作用愈发受到关注。淋巴结作为T细胞活化、扩增和迁移的主要器官肿瘤在淋巴结内如何逃避免疫杀伤是靶向早期转移的关键科学问题但目前相关机制尚不明确。在此背景下本研究通过 单细胞RNA测序和 单细胞T细胞受体测序技术对 HNSCC 原发灶与早期淋巴结转移灶进行多维度分析旨在揭示转移前肿瘤亚群及可靶向的脆弱点、明确肿瘤靶向性T细胞的演化轨迹以及揭示肿瘤在淋巴结转移过程中逃避免疫杀伤的通路为开发精准抗转移治疗策略提供依据。如果你希望有人真的手把手教你学R语言单细胞更多课程Python版scRNA-seq分析全流程Python 空间转录组全程班如果需要 单细胞数据分析指导、生信热点 全文复现、自测数据个性化分析辅导、 常态化实验学习欢迎联系[Biomamba_zhushou]。二、主要内容1 头颈部鳞状细胞癌原发灶与转移灶的单细胞转录景观对应图 1①研究纳入 14 例未经治疗的局部晚期 HPV 阴性 HNSCC 患者获取原发灶和颈部淋巴结样本对 7 对样本进行单细胞 RNA 测序scRNAseq和单细胞 T 细胞受体测序scTCRseq成功构建 7 例患者来源的原代培养体系PDCs 。最终获得 53459 个细胞涵盖 23148 个基因的 scRNAseq 数据通过 Seurat v3.0 软件完成细胞标准化、聚类与注释 。②细胞类型与分布差异通过经典标志物将细胞注释为上皮细胞KRT7、KRT17、唾液腺细胞STATH、成纤维细胞COL1A2、内皮细胞PECAM和免疫细胞PTPRC五大类其中成纤维细胞进一步分为癌相关成纤维细胞CAFsMMP2⁺和肌成纤维细胞ACTA2⁺免疫细胞细分为 T 细胞、NK 细胞、B 细胞等 。空间分布上原发灶中 CAFs 和肿瘤相关巨噬细胞TAMs比例更高转移灶中 B 细胞、浆细胞和树突状细胞更富集符合淋巴结组织免疫特征 。癌细胞 拷贝数变异验证对上皮细胞的拷贝数变异CNA分析显示95% 的细胞存在明显拷贝数改变如 7 号染色体扩增、3p 染色体缺失证实该亚群以癌细胞为主且原发灶与转移灶癌细胞的 CNA 存在显著重叠提示两者的演化关联性 。③图 1 关键信息Fig.1图 1 展示了样本处理流程a、所有细胞的 UMAP 聚类按组织来源和细胞类型b、c、不同患者原发灶与转移灶的细胞组成差异d以及癌细胞染色体拷贝数变异情况e。该图清晰呈现了 HNSCC 原发灶与转移灶的单细胞景观差异为后续聚焦癌细胞和 CD8⁺T 细胞分析奠定基础 。2转移前肿瘤细胞的识别与靶向验证对应图 2、图 3①癌细胞转移轨迹与转移前细胞特征图 2Fig.2EMT 梯度化特征对比原发灶与转移灶癌细胞的 EMT 评分发现除 1 例患者HN257外其余患者转移灶癌细胞 EMT 评分均高于原发灶但整体无统一的 “全或无” EMT 模式支持 “EMT 呈梯度化” 的结论 。转移前细胞亚群识别识别出三种转移轨迹模式①有序渐进型如 HN251、HN242原发灶→转移灶呈阶段性转变EMT、氧化磷酸化通路富集②原发灶持续演化型如 HN272转移前通路可识别但原发灶同时存在独立演化③无方向杂乱型如 HN257原发灶 EMT 评分更高存在高侵袭性去分化亚群SNAI2⁺且该亚群基因特征与 TCGA 数据库中 HNSCC 患者不良预后相关 。可干预靶点筛选通过 GeneSwitches 算法在转移前细胞中筛选出 AXL、AURKB极光激酶 B等关键基因且在外部验证数据集Puram 等人的 HNSCC scRNAseq 数据中也检测到这些基因的高表达 。②靶点功能验证图 3Fig.3患者来源培养体系PDCs验证在 PDCs 中HN137原发灶的 “转移前细胞” 高表达 AXLHN159、HN220 的 “转移前细胞” 高表达 AURKB且免疫组化、流式细胞术均证实这些基因的蛋白表达 。抑制剂功能实验使用 AXL 抑制剂BGB324和 AURK 抑制剂巴拉塞替处理 PDCs结果显示BGB324 可显著降低 HN137 原发灶和转移灶细胞的侵袭能力且仅特异性抑制 AXL 高表达亚群巴拉塞替可降低 HN159、HN220 转移灶细胞的侵袭能力但对克隆形成能力无影响 、。此外TCGA 数据显示 AXL 表达与 EMT 评分呈正相关进一步支持 AXL 作为抗转移靶点的潜力 。③图 2、图 3 关键信息图 2 通过 UMAP 聚类、EMT 评分箱线图、Monocle 轨迹及生存分析明确转移前细胞的特征与临床意义图 3 则通过 PDCs 的 PAGODA 分析、靶点表达验证及抑制剂功能实验证实 AXL 和 AURKB 对肿瘤侵袭的调控作用。3CD8⁺T 细胞功能异常轨迹与调控机制对应图 4、图 5①CD8⁺T 细胞的分化轨迹图 4Fig.4T 细胞聚类与亚群定义从 10168 个 T 细胞涵盖 13729 个基因中提取 3387 个 CD8⁺T 细胞注释为 naive 样、过渡型、组织驻留记忆型TRM、前功能异常型、增殖型和晚期功能异常型 6 个亚群 。两条功能异常轨迹利用 Slingshot软件以 “CXCL13⁺LAYN⁺耗竭细胞” 为终点识别出两条分化轨迹①Trajectory 1naive→功能异常naive 细胞从淋巴结迁移至原发灶逐渐丢失 naive 标志物TCF7、IL7R获得功能异常标志物TIM3、CTLA4中间伴随增殖爆发MKI67⁺②Trajectory 2TRM→功能异常TRM 细胞本身高表达组织驻留标志物ITGA4和功能异常标志物基因激活事件更少 。②SOX4 的功能验证与 T 细胞克隆结构图 5Fig.5SOX4 与 T 细胞耗竭的关联在外部数据集Puram 的 HNSCC scRNAseq、皮肤鳞状细胞癌 PD-1 治疗前后 scRNAseq中SOX4 在功能异常 / 耗竭型 CD8⁺T 细胞中高表达且 PD-1 治疗后 SOX4 表达降低 。RNA 干扰实验显示敲低 SOX4 可显著减少 PBMC 和肿瘤浸润淋巴细胞TILs中 PD1⁺、CD39⁺功能异常细胞的比例证实 SOX4 对 T 细胞耗竭的调控作用 。T 细胞克隆结构分析scTCRseq 共识别 1590 个独特 TCR 序列17.39% 的 CD8⁺T 细胞存在克隆扩增且 7 例患者中有 6 例的原发灶与转移灶存在克隆重叠 。克隆演化支持两种模型①克隆替换如 HN272淋巴结 naive 克隆迁移至原发灶并分化为功能异常型②克隆复苏如 HN263原发灶 TRM 细胞重新激活并扩增 。③图 4、图 5 关键信息图 4 通过 UMAP 聚类、基因表达热图和轨迹分析明确 CD8⁺T 细胞的分化路径与基因表达变化图 5 通过外部数据集验证、RNA 干扰实验和 scTCRseq证实 SOX4 的调控作用及 T 细胞克隆的双向迁移特征为免疫治疗联合靶向 SOX4 提供依据 。④转移前细胞与 CD8⁺T 细胞的免疫逃逸通路对应图 61细胞相互作用组分析利用 Cellchat 软件分析原发灶 “普通细胞”“转移前细胞” 与免疫细胞的相互作用发现转移前细胞与 CD8⁺T 细胞的相互作用显著增强且中期因子MDK通路是核心免疫抑制通路 —— 肿瘤细胞分泌的 MDK 可与 CD8⁺T 细胞表面的 ITGA4、ITGB1 等受体结合 。2MDK通路的功能验证体外抑制实验用 MDK 抑制剂处理患者肿瘤单细胞悬液可降低非 T 细胞比例、提高 CD8⁺T 细胞比例同时减少癌细胞panCK⁺及增殖型癌细胞ki67⁺数量提示 MDK 可抑制 CD8⁺T 细胞的抗肿瘤活性 。人源化小鼠模型验证将 HN279 转移前细胞移植到 NOG-EXL 人源化小鼠中抗 PD-1 治疗帕博利珠单抗可缩小肿瘤体积但 MDK⁺癌细胞比例无变化进一步分析发现MDK 受体⁺CD8⁺T 细胞中功能异常型比例升高、增殖型比例降低且与 NFKB1 激活相关证实 MDK 通路可削弱 PD-1 治疗的 T 细胞激活效应 。3图 6 关键信息Fig.6图 6 通过 Cellchat 相互作用网络图、MDK 通路 ligand-receptor 分析、体外抑制实验及人源化小鼠实验明确 MDK 通路在转移前细胞免疫逃逸中的核心作用为 “MDK 抑制剂联合 PD-1抑制剂” 的联合治疗策略提供了实验依据。三、总结与展望本研究通过单细胞技术解析HNSCC早期淋巴结转移机制核心结论包括1转移前细胞与可干预靶点识别出三种癌细胞转移轨迹筛选出 AXL、AURKB 为转移前细胞的关键靶点抑制剂可显著降低肿瘤侵袭能力2CD8⁺T 细胞功能异常机制CD8⁺T 细胞存在两条功能异常轨迹SOX4 是介导 T 细胞耗竭的核心调控因子敲低 SOX4 可逆转功能异常表型3免疫逃逸通路MDK 通路是转移前细胞与 CD8⁺T 细胞相互作用的关键免疫抑制通路可削弱 PD-1 治疗效果MDK 抑制剂有望增强免疫治疗应答。创新点①技术与分析创新整合 scRNAseq、 scTCRseq与 轨迹分析Monocle、Slingshot、相互作用组分析Cellchat首次在单细胞水平完整解析 HNSCC 早期转移的 “肿瘤 - 免疫” 双向机制②靶点与通路创新发现 AXL/AURKB 对转移前细胞侵袭的调控作用明确 SOX4 介导 T 细胞耗竭、MDK 通路介导免疫逃逸的新机制为抗转移与免疫治疗联合提供新方向③临床转化价值创新通过患者来源培养体系和人源化小鼠模型验证靶点功能结果与 TCGA 临床数据关联为 HNSCC 精准治疗提供可转化的靶点与策略。本研究综合运用多种前沿技术与分析方法具体包括① 单细胞RNA测序scRNAseq构建原发灶与淋巴结转移灶的 “全肿瘤” 单细胞转录组图谱识别肿瘤细胞、免疫细胞及基质细胞的亚型与基因表达特征。研究对 14 例未治疗局部晚期 HPV 阴性 HNSCC 患者的原发灶与颈部淋巴结标本进行处理其中 7 对标本用于 scRNAseq 分析共获得 53,459 个细胞每例患者 3,553-11,308 个细胞和 23,148 个基因的表达数据同时对 7 例患者来源的原代细胞PDCs进行 C1 平台 scRNAseq 分析获取 1,317 个细胞和 55,216 个基因的信息。② 单细胞 T 细胞受体测序scTCRseq解析 CD8T 细胞的克隆结构、克隆扩增特征及迁移规律验证 T 细胞功能分化轨迹的克隆关联性。研究对 7 对 HNSCC 标本中的 T 细胞进行 scTCRseq 分析共恢复 1,461 个 TCRα 和 1,948 个 TCRβ 有效序列识别出 1,590 个独特 TCR 序列。③ 人源化小鼠模型与体内药效实验采用 NOG-EXLhGM-CSF/hIL-3 NOG雌性小鼠预先移植人脐带血来源的 CD34 造血干细胞构建人源化免疫系统随后在小鼠双侧 flank 接种 HNSCC 患者 HN279 的转移前细胞建立 HNSCC 异种移植模型。将模型小鼠随机分为对照组PBS 处理与抗 PD-1 治疗组pembrolizumab 处理定期监测肿瘤大小实验终点收集肿瘤组织进行 scRNAseq 分析比较两组小鼠肿瘤细胞的增殖相关基因AURKB、TOP2A表达、CD8T 细胞亚型分布增殖型、功能障碍型等及 MDK-NFKB1 信号通路活性验证 MDK 通路对免疫检查点阻断治疗效果的影响。④ 免疫组化IHC与免疫荧光IF验证关键靶点AXL、AURKB在患者肿瘤组织及 PDCs 中的蛋白表达水平。研究对 HN137 PDCs 中的 AXL、HN159/HN220 PDCs 中的 AURKB 进行 IHC/IF 染色通过显微镜观察蛋白定位与表达强度结合 ImageJ 定量分析确认靶点在转移前细胞中的高表达特征为靶点的临床相关性提供组织层面证据。⑤ 流式细胞术Flow Cytometry检测细胞表面标志物如 AXL、CD8、PD1、 intracellular 蛋白如 AURKB、Ki67的表达分选特定细胞亚群如 AXL 高 / 中 / 低表达细胞以及分析 T 细胞功能如 IFN-γ 分泌、CD107a 脱颗粒。研究通过流式细胞术验证 AXL、AURKB 在 PDCs 中的表达差异分选 AXL 不同表达亚群进行侵袭实验同时检测 MDK 抑制剂处理后 CD8T 细胞、癌细胞的比例变化量化免疫细胞功能状态为功能实验提供定量数据。⑥ 拷贝数变异CNA分析采用 InferCNVv1.2.2和 CopyKatv1.0.8算法以免疫细胞、成纤维细胞等非恶性细胞为对照对上皮细胞癌细胞的染色体拷贝数变异进行推断与量化。验证上皮细胞的恶性属性95% 上皮细胞存在明显 CNA并检测到 HNSCC 中常见的 CNA 事件如 7 号染色体和 8q 扩增、3p 和 5q 缺失通过比较原发灶与转移灶的 CNA 重叠情况证实转移灶癌细胞与原发灶癌细胞的克隆关联性为肿瘤进化模式分析提供遗传变异依据。研究局限性与未来展望1局限性1. 样本量限制仅纳入 14 例患者7 对样本用于测序样本量较小可能影响结论的普适性2. 细胞类型覆盖不足聚焦于癌细胞和 CD8⁺T 细胞对 CAFs、TAMs 等其他细胞类型的作用未深入探讨2未来展望1. 扩大样本与多中心验证2. 空间转录组整合3. 动态模型构建