标 题CD160 dictates anti-PD-1 immunotherapy resistance by regulating CD8 T cell exhaustion in colorectal cancer影 响 因 子IF19.1发 表 时 间2025年9月发 表 期 刊《Nature Cell Biology》一、研究背景结直肠癌colorectal cancer, CRC是全球发病率极高的消化道恶性肿瘤严重威胁人类生命健康。临床解剖与组织学研究发现空肠与结肠在组织结构、转录组特征及解剖毗邻关系上具有高度相似性但二者肿瘤发生风险存在显著差异结肠癌变发生率远高于空肠目前介导这一差异的核心分子机制尚未明确。在CRC临床免疫治疗领域抗PD-1抗体已成为微卫星高度不稳定MSI-H型CRC的核心治疗方案可显著改善部分患者预后但近半数MSI-H患者会出现原发性或继发性耐药极大限制了免疫治疗的整体疗效。CD160是主要表达于淋巴细胞表面的关键膜分子在肠道上皮内淋巴细胞intraepithelial lymphocytes, IEL中呈特异性高表达。现有研究多聚焦于CD160的基础免疫表达特征但其在CRC肿瘤免疫微环境中的具体调控功能、对肠道T细胞免疫稳态的影响以及是否参与介导抗PD-1免疫耐药目前尚无明确研究报道。二、实验设计该研究以健康人群、CRC患者的空肠、结肠及肿瘤组织样本为研究对象通过多组学联合分析对比肠道不同节段的免疫生态差异筛选核心差异免疫分子及细胞亚群重点聚焦CD160⁺CD8⁺T细胞的生物学特征与功能机制。通过临床样本分析、多维度体外细胞实验、小鼠体内功能验证及机制探究逐层解析CD160在CRC免疫调控中的核心作用。人群样本多组学分析结果证实空肠组织特异性富集CD160⁺CD8⁺T细胞该细胞亚群具备抵抗T细胞终末耗竭、高效克隆扩增的优势特征。体内功能实验显示过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可显著抑制MSI-H型CRC及炎症诱导型CRC的肿瘤增殖而Cd160基因敲除会显著加速肿瘤进展且该促癌表型可通过外源回输CD160⁺CD8⁺T细胞有效逆转。更重要的是在MSI-H CRC及抗PD-1耐药模型中CD160⁺CD8⁺T细胞可显著增敏抗PD-1免疫治疗、逆转耐药表型通过富集肿瘤微环境中的前体耗竭T细胞实现肿瘤病灶的有效清除。机制层面CD160可直接结合PI3K调节亚基p85α激活下游AKT–NF-κB信号通路进而上调T细胞表面FcεR1γ与4-1BB的表达最终显著增强CD8⁺T细胞的肿瘤杀伤毒性。综上该研究明确了CD160是调控CD8⁺T细胞功能稳态的关键分子证实CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移是攻克CRC抗PD-1耐药的创新免疫治疗策略为CRC精准免疫治疗提供了全新理论依据。三、实验方法与结果3.1 空肠与结肠组织的免疫生态特征差异为揭示空肠、结肠癌变风险差异的免疫学机制该研究收集健康人群与CRC患者的回肠、结肠及肿瘤组织样本整合单细胞转录组测序scRNA-seq、单细胞TCR测序scTCR-seq、单细胞BCR测序scBCR-seq技术系统性构建肠道不同节段及CRC肿瘤组织的免疫细胞全景图谱。测序结果显示回肠组织中特异性富集高表达CD160的CD8⁺T细胞亚群该细胞亚群免疫活化活性更强、细胞耗竭水平显著更低反观结肠正常组织及CRC肿瘤组织中CD160⁺CD8⁺T细胞的浸润数量显著减少。进一步临床预后分析表明肿瘤免疫特征趋近于回肠免疫微环境的“回肠型”CRC患者整体预后显著优于其他亚型患者。上述结果证实回肠组织具备更强的抗肿瘤免疫活性与杀伤潜能而CD160⁺CD8⁺T细胞是维持肠道强效抗肿瘤免疫微环境的核心标志性细胞。3.2 CD160精准界定CD8⁺T细胞耗竭动态轨迹持续性肿瘤抗原刺激会诱导T细胞从活化状态逐步向前体耗竭TPex 、终末耗竭TTex 状态动态转化是导致肿瘤免疫逃逸、免疫治疗失效的核心原因。该研究通过多维度细胞亚群分型分析精准解析了肠道及肿瘤微环境中T细胞的耗竭演变规律共鉴定出6种CD4⁺T细胞亚型、8种CD8⁺T细胞亚型及γδT细胞亚群。结果显示CD160仅特异性表达于T细胞前体耗竭阶段是界定具有免疫再激活潜能T细胞的新型标志物。CD160⁺T细胞维持高细胞毒性、低耗竭的功能特征而CD160⁻T细胞多处于不可逆的功能衰竭状态。细胞分布特征分析表明回肠组织中IEL-T细胞经典活化标志物高表达、活化相关基因显著上调而CRC肿瘤组织中CD4⁺、CD8⁺T细胞活化基因表达下调耗竭相关基因异常激活。Treg、TFH细胞主要富集于肿瘤组织与引流淋巴结回肠及结肠正常组织以初始T细胞、中心记忆T细胞、效应记忆T细胞为主CD4⁺细胞毒性T细胞则主要分布于外周血与回肠组织。新抗原反应性分析证实CRC肿瘤浸润的Treg、TFH及TCRαβ⁺IEL-T细胞呈现肿瘤特异性活化状态而健康人群回肠T细胞的新抗原反应性最低。其中CRC组织中的TCRαβ⁺IEL-T细胞兼具最高的活化与耗竭特征且富集大量预后相关基因及免疫检查点阻断治疗应答相关基因。耗竭亚型分层分析显示正常回肠、结肠组织的IEL-T细胞以良性前体耗竭表型为主而CRC肿瘤组织中IEL-T细胞多进展为恶性终末耗竭表型γδT细胞的细胞毒性则呈现“回肠最高、肿瘤最低”的分布特征进一步印证了肠道不同节段的免疫功能差异。3.3 CD160调控CD8⁺T细胞耗竭状态的动态转变为明确CD160与T细胞耗竭转化的关联该研究针对TCRαβ⁺IEL-T细胞开展伪时间轨迹分析。结果显示T细胞耗竭轨迹起源于正常回肠、结肠组织后续分化出两条肿瘤特异性富集分支。沿伪时间推演进程T细胞终末耗竭信号持续增强前体耗竭信号逐步衰减完美复刻了前体耗竭T细胞向终末耗竭T细胞的恶性转化过程。经典耗竭标志物分析显示终末耗竭标志基因EOMES、TOX的表达量随伪时间进展持续上调而前体耗竭标志基因IL7R、REL的表达显著下调。CD160在回肠、结肠、肿瘤组织中呈动态差异性表达其表达水平与IEL-T细胞耗竭状态转化高度耦合。多重免疫荧光染色与流式细胞术检测结果一致证实CD160⁺CD8⁺T细胞浸润比例为回肠最高、CRC肿瘤组织最低小鼠模型实验也验证了该组织分布规律。相关性分析表明CD160表达水平与T细胞前体耗竭表型呈显著正相关与终末耗竭表型呈显著负相关明确其为前体耗竭T细胞的特异性标志分子。T细胞克隆谱系分析显示CRC肿瘤组织中的TCRαβ⁺IEL-T细胞克隆大多起源于肠道正常组织的CD160⁺T细胞克隆肿瘤特异性T细胞克隆中终末耗竭细胞比例显著升高、前体耗竭细胞比例降低。正常组织中CD160⁺CD8⁺T细胞具备更强的克隆扩增能力而肿瘤微环境中该优势显著减弱。跨组织转录特征分析证实CD160⁺CD8⁺T细胞在不同组织中均维持稳定的前体耗竭表型与一致的转录特征CD160⁻CD8⁺T细胞则更易进展为终末耗竭状态。MC38小鼠模型实验进一步验证CD160⁺CD8⁺T细胞的前体耗竭比例显著高于CD160⁻细胞。上述结果表明CD160可稳定维持CD8⁺T细胞的前体耗竭特性有效抑制T细胞耗竭进程。3.4 CD160⁺CD8⁺T细胞兼具高细胞毒性与抗耗竭能力并抑制结直肠癌进展该研究结合人类临床样本与多种小鼠CRC模型系统验证了CD160⁺CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能。体外功能实验结果显示相较于CD160⁻CD8⁺T细胞CD160⁺CD8⁺T细胞可分泌更高水平的颗粒酶B与干扰素γ具备更强的肿瘤细胞杀伤活性在长期持续性抗原刺激的体外模型中CD160⁺CD8⁺T细胞的抗耗竭能力显著优于CD160⁻细胞终末耗竭表型发生率显著降低。体外刺激实验证实经CD3/CD28共刺激活化后CD160⁺CD8⁺T细胞中GzmB阳性功能性细胞比例显著升高细胞毒性功能显著增强慢性抗原刺激模型中CD160⁺CD8⁺T细胞可有效抵抗终末耗竭转化维持稳定的免疫功能。将小鼠MC38肿瘤模型中分离扩增的CD160⁺CD8⁺T细胞与自体肿瘤细胞共培养后可显著诱导肿瘤细胞凋亡杀伤效果显著优于CD160⁻细胞。体内过继转移实验显示CD160⁺CD8⁺T细胞可高效浸润至肿瘤组织并快速获得肿瘤抗原特异性杀伤能力。在AOM/DSS炎症诱导型CRC小鼠模型中过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞可显著减少肿瘤数量、缩小肿瘤体积而CD160⁻CD8⁺T细胞无明显抗肿瘤效应。无论在肿瘤早期或晚期干预回输CD160⁺CD8⁺T细胞均可有效提升肿瘤浸润CD8⁺T细胞的GzmB表达水平持续抑制肿瘤增殖进展。上述结果证实CD160⁺CD8⁺T细胞兼具高细胞毒性、抗耗竭、强效抗肿瘤的三重特征且其抗肿瘤效应依赖于肿瘤免疫原性。3.5 CD160缺失诱导CD8⁺T细胞终末耗竭、削弱抗肿瘤免疫功能为明确CD160的功能必要性该研究构建Cd160全基因敲除Cd160⁻/⁻小鼠通过AOM/DSS炎症诱导模型与MC38皮下荷瘤模型探究CD160缺失对CRC进展及T细胞功能的影响。结果显示相较于野生型小鼠Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤发生数量更多、肿瘤体积更大肿瘤进展速度显著加快。Rescue实验结果表明向Cd160⁻/⁻小鼠体内过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞可显著逆转肿瘤快速进展的表型有效抑制肿瘤生长而转移CD160⁻CD8⁺T细胞无法发挥抗肿瘤作用。免疫微环境分析显示Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤组织中浸润的GzmB⁺功能性CD8⁺T细胞数量显著减少而过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复功能性T细胞比例该结果经免疫组化实验进一步验证。T细胞耗竭表型分型结果显示Cd160⁻/⁻小鼠肿瘤浸润CD8⁺T细胞中TCF1⁺PD-1⁺前体耗竭细胞比例显著下降TCF1⁻PD-1⁺终末耗竭细胞比例异常升高T细胞耗竭进程显著加速。过继转移CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复前体耗竭T细胞储备、抑制终末耗竭转化而CD160⁻CD8⁺T细胞无此修复功能。综上CD160缺失会直接损伤CD8⁺T细胞的细胞毒性功能加速T细胞终末耗竭促进CRC恶性进展同时减少对抗PD-1治疗敏感的前体耗竭T细胞亚群揭示了CD160在提升CRC免疫治疗疗效中的潜在核心价值。3.6 CD160⁺CD8⁺T细胞增敏抗PD-1治疗、克服MSI-H CRC免疫耐药该研究进一步验证了CD160⁺CD8⁺T细胞对CRC抗PD-1免疫治疗的增敏作用。MC38荷瘤小鼠模型干预结果显示CD160⁺CD8⁺T细胞联合抗PD-1抗体治疗可几乎完全清除肿瘤病灶疗效显著优于单独抗PD-1治疗、单独细胞回输治疗而CD160⁻CD8⁺T细胞无法增强抗PD-1治疗效果。机制层面CD160⁺CD8⁺T细胞可显著提升肿瘤微环境中GzmB⁺功能性CD8⁺T细胞比例联合治疗组的免疫活化效果最为显著。同时CD160⁺CD8⁺T细胞可特异性上调TCF1⁺PD-1⁺前体耗竭T细胞比例不影响终末耗竭T细胞水平有效储备具有免疫再激活潜能的T细胞该现象经多重免疫组化实验进一步证实。在AOM/DSS诱导的耐药型CRC模型中单独抗PD-1抗体治疗无明显抑瘤效果而联合CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移可显著降低肿瘤负荷、小幅延长小鼠生存期。临床样本验证方面纳入13例接受抗PD-1免疫治疗的MSI-H型CRC患者进行回顾性分析结果显示免疫治疗敏感组患者的肿瘤浸润CD8⁺T细胞中CD160表达水平显著高于耐药组且CD160高表达与患者预后改善显著相关该预后预测价值独立于CD8⁺T细胞浸润密度。针对抗PD-1耐药的MC38模型过继回输CD160⁺CD8⁺T细胞可有效恢复肿瘤对抗PD-1治疗的敏感性实现肿瘤近乎完全清除同时显著提升肿瘤微环境中功能性GzmB⁺CD8⁺T细胞与前体耗竭T细胞比例而CD160⁻CD8⁺T细胞无逆转耐药的作用。上述体内外实验与临床样本数据共同证实CD160⁺CD8⁺T细胞可有效提升MSI-H CRC的免疫治疗敏感性是逆转抗PD-1耐药的关键细胞亚群。3.7 CD160通过AKT–NF-κB通路激活并维持CD8⁺T细胞抗肿瘤功能为阐明CD160调控CD8⁺T细胞功能的分子机制该研究对小鼠脾脏分选的CD160⁺、CD160⁻CD8⁺T细胞进行转录组差异分析。结果显示CD160⁺CD8⁺T细胞中Fcer1g、Tnfrsf94-1BB基因显著上调差异基因主要富集于T细胞活化、NF-κB信号通路及T细胞介导的细胞毒性通路。基因功能验证实验表明CD160过表达可显著诱导CD160⁻CD8⁺T细胞上调FcεR1γ与4-1BB表达敲低Fcer1g或Tnfrsf9可显著降低CD160⁺CD8⁺T细胞的GzmB表达水平、削弱细胞毒性而过表达上述两个基因可有效恢复CD160⁻CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能。临床样本与动物模型检测结果一致显示CRC患者及MC38荷瘤小鼠的肿瘤浸润CD160⁺CD8⁺T细胞中FcεR1γ与4-1BB均维持高水平表达。通路机制研究证实CD160⁺CD8⁺T细胞可特异性激活经典NF-κBp65信号通路促进p65蛋白核转位进而启动下游Fcer1g、Tnfrsf9基因的转录激活阻断NF-κB核转位可显著抑制上述基因的表达逆转T细胞高活性表型。同时CD160⁺CD8⁺T细胞中PI3K–AKT通路持续活化p-AKT蛋白表达水平显著升高。免疫共沉淀与邻近标记实验证实CD160可直接结合PI3K调节亚基p85α弱结合p110δ亚基与其他PI3K p110家族亚基无相互作用。分子动力学模拟分析进一步验证CD160与p85α的结合模式稳定性最高。功能回补实验显示敲低p85α可完全阻断CD160介导的AKT磷酸化及GzmB表达上调而敲低p110δ无明显抑制效果。综上CD160通过特异性结合PI3K p85α激活AKT–NF-κB信号通路上调FcεR1γ与4-1BB表达最终维持CD8⁺T细胞的高细胞毒性与抗耗竭功能。四、研究总结该研究依托单细胞多组学技术系统绘制了人类回肠、正常结肠及CRC肿瘤组织的免疫细胞全景图谱阐明了肠道不同节段免疫微环境的功能差异从免疫学角度解释了空肠与结肠癌变风险差异的核心机制。研究首次证实回肠组织特异性富集的CD160⁺CD8⁺T细胞具备强克隆扩增能力、抵抗终末耗竭、高细胞毒性的核心特征是肠道天然抗肿瘤免疫屏障的关键细胞亚群而CRC肿瘤微环境会诱导T细胞持续耗竭破坏肠道免疫防御稳态。伪时间轨迹与克隆谱系分析明确了CD160是CD8⁺T细胞前体耗竭状态的特异性标志物可跨组织稳定维持T细胞的可逆性活化潜能抑制T细胞向终末耗竭状态转化。多维度体内外功能实验证实CD160⁺CD8⁺T细胞可强效抑制CRC肿瘤增殖提升肿瘤微环境中功能性免疫细胞比例显著增强MSI-H CRC对抗PD-1免疫治疗的敏感性有效逆转临床常见的免疫耐药难题。机制层面该研究阐明了全新的CD160调控通路CD160通过直接结合PI3K调节亚基p85α激活下游AKT–NF-κB信号通路上调FcεR1γ与4-1BB分子表达进而持续维持CD8⁺T细胞的活化状态与肿瘤杀伤毒性。该研究完善了CRC肿瘤免疫微环境的调控网络确立了CD160作为CRC免疫治疗新型靶点的科学价值创新性提出CD160⁺CD8⁺T细胞过继转移的免疫治疗新策略为破解MSI-H CRC抗PD-1耐药、提升临床免疫治疗疗效提供了坚实的理论基础与实验依据。