双抗夹心ELISA是检测抗原最常用的方法。其基本原理是将特异性抗体捕获抗体以物理吸附方式固定于微孔板表面加入待测标本后标本中的抗原与固相抗体特异性结合洗涤后加入酶标记的特异性抗体检测抗体形成“捕获抗体—抗原—检测抗体”三元复合物最后加入底物显色颜色的深浅与待测抗原的浓度呈正相关。下面以云克隆双抗夹心法商业试剂盒为例详细阐述ELISA的操作流程及技术要点供广大科研工作者参考。一、试剂准备1. 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温18-25℃如果该试剂盒在一段时间内不能使用请仅取出本次试验所需的酶标条和试剂并将剩余的酶标条及试剂按指定条件保存。2. 标准品冻干品每瓶标准品加入相应体积标准品稀释液加入体积以说明书介绍为准盖好后室温静置大约10分钟同时轻轻摇动避免起泡。先将其稀释为标准曲线最高浓度后再准备7个稀释标准品的EP管每个EP管中加入500μL的标准品稀释液如图所示依次倍比稀释标准品稀释液0pg/mL直接作为空白孔。为保证实验结果有效性每次实验请使用新的标准品溶液。图1 标准品倍比稀释示意图3. 检测溶液A及检测溶液BDetection A及Detection B在使用前请用手甩几下或短暂离心处理以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B 100倍稀释如10μL检测溶液A/990μL检测稀释液A充分混匀稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制100μL/孔实际配制时应多配制0.1-0.2mL。4. 浓洗涤液580mL蒸馏水或去离子水加入20mL洗涤液30×稀释至600mL至工作液浓度。5. 底物溶液请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用容器中剩余的底物应予丢弃不要倒回TMB瓶中。二、试剂准备注意事项1. 标准品的稀释不能直接在板中进行。2. 标准品请于临用前15分钟内配制。该标准品只能使用一次。3. 标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请使用相应的稀释液配制稀释液不能混用。用移液枪轻轻吹打充分混匀避免起泡。为保证实验结果的准确性请使用微量吸管并校准微量移液器。请依据所需的量精确配制尽量不要使用微量配制的方法如吸取检测溶液A时一次不要小于10μL以避免造成浓度误差。4. 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液A工作液和检测溶液B工作液。5. 洗涤液30x中如有结晶析出请先温育至室温轻轻混匀至到结晶完全溶解再进行配制。6. 试剂盒中部分试剂为储存液客户需配置成工作液后使用在配置过程中可能因为纯净水质量差或水质污染以及实验中所用耗材洁净度差造成实验结果不准确甚至完全错误。请使用双蒸水配置。三、操作步骤1. 加样分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔依次加入100μL不同浓度的标准品见试剂准备。空白孔加100μL标准品稀释液余孔加待测样品100μL酶标板加上覆膜37℃温育1小时。2. 弃去液体甩干不用洗涤。3. 每孔加检测溶液A工作液100μL临用前配制酶标板覆膜37℃温育1小时。4. 弃去孔内液体每孔用350μL的洗涤液洗涤浸泡1-2分钟在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液将酶标板倒扣在吸水纸上将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用喷射瓶多道移液器 或自动洗板机来完成。5. 每孔加检测溶液B工作液临用前配制100μL酶标板覆膜37℃温育30分钟。6. 弃去孔内液体甩干洗板5次方法同步骤4。7. 每孔加TMB底物溶液90μL酶标板覆膜37℃避光显色反应时间控制在10-20分钟不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色后3-4孔梯度不明显时即可终止。8. 每孔加终止溶液50μL终止反应此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。9. 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值O.D.值。四、操作步骤注意事项1. 试剂准备准备一次实验所需要的酶标条其它的可从微孔板上拆下密封按照说明书要求保存以备下次使用。2. 加样实验操作中请使用一次性的灭菌吸头避免污染。加样时注意不要有气泡产生将样品加于酶标板底部尽量不触及孔壁轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔尽量小一般控制在10分钟以内如果太大将会导致不同的“预温育”时间从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。为了测值的准确性推荐设置复孔进行实验。3. 温育为防止样品蒸发实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内以避免液体蒸发洗板后应尽快进行下步操作任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态同时应严格遵守给定的温育时间和温度。4. 洗涤充分洗涤非常重要在每次洗涤过程中都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印避免影响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机请在熟练使用后再用于正式实验过程中。5. 反应时间的控制加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化比如每隔10分钟观察一次如观察到颜色较深请提前加入终止液终止反应避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。6. 底物底物请避光保存在储存和温育时避免强光直接照射。7. 如果实验室内湿度低于60%推荐使用加湿器提高湿度水平。