蛋白互作是生命活动的核心机制之一也是国自然基金项目中“机制研究”的关键突破口。然而如何选择最合适的研究方法既能满足创新性要求又能让评审专家眼前一亮PS国自然对于蛋白互作的证据一般需要2-3种阳性实验结果建议同时包含体内外水平验证结果。本期为大家介绍10种无需特殊仪器设备的蛋白互作检测方法主要包括Co-IP、Pull-down、酵母双杂交、荧光共定位、双分子荧光互补、荧光素酶互补、荧光共振能量转移、邻位连接、邻近标记以及酶联免疫吸附实验。体内水平加分指数☆☆☆免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation, Co-IP基于抗原-抗体特异性结合原理使用靶蛋白特异性抗体捕获靶蛋白复合物经离心沉淀、洗涤和洗脱过程获得纯化的靶蛋白-互作蛋白复合物实现复杂样本中目标蛋白的富集及相互作用验证。✅技术流程1收集细胞并裂解提取总蛋白2特异性抗体富集目的蛋白复合体3磁珠Protein A/G捕获抗体-目的蛋白复合体4洗涤液洗涤磁珠5洗脱液洗脱蛋白复合体6Western blot检测或者质谱鉴定。✅技术优势体内天然状态下验证互作接近正常生理水平蛋白处理细胞生理环境下避免人为干扰分离天然状态下的蛋白进行功能检测。体外水平加分指数☆☆☆GST Pull-down技术将已知蛋白与GST标签融合表达纯化并固定在含谷胱甘肽GSH的琼脂糖珠形成已知蛋白-GST-GSH-琼脂糖珠复合体随后与蛋白样本共孵育捕获与已知蛋白相互作用蛋白并进行Western blot检测或者质谱鉴定。✅技术流程1利用蛋白表达系统体外表达并纯化GST融合蛋白2收集细胞并裂解提取总蛋白3将总蛋白溶液与固定在GSH-琼脂糖珠上的GST融合蛋白共孵育4收集并洗涤琼脂糖珠5洗脱液洗脱蛋白复合体6Western blot检测或者质谱鉴定。✅技术优势直接验证蛋白相互作用证据扎实蛋白标签与固相支持物亲和力强洗脱纯度高无需抗体亲和作用结合富集效果好体内水平加分指数☆☆酵母双杂交Yeast Two Hybrid, Y2H技术将已知的诱饵蛋白X与BD结构域融合表达捕获蛋白Y与AD结构域融合表达。若蛋白A和蛋白B存在互作则BD和AD在空间上会靠近成为有活性的转录激活因子激活下游报告基因表达。✅技术流程1制备酵母感受态细胞2构建目的蛋白-BD和待测试蛋白-AD融合表达质粒3将表达质粒转化至酵母感受态细胞并培养4利用三缺和四缺平板进行结果鉴定✅技术优势基于报告基因表达产物累积效应检测灵敏度高可用于检测弱蛋白相互作用或者瞬时相互作用无需抗体或者蛋白纯化操作相对其他方法成本较低体内水平加分指数☆荧光共定位Fluorescence Colocalization, FC技术将目的蛋白和待测试蛋白分别利用不同荧光信号进行标记通过观察荧光显微镜下不同荧光信号的位置判断蛋白是否互作。✅技术流程荧光共定位1分别构建带有不同荧光标签的目标蛋白和待测试蛋白表达质粒2将表达质粒转染至细胞并培养3荧光显微镜观察荧光信号定位情况✅技术流程免疫荧光共定位1细胞培养至合适密度后固定处理2使用特异性抗体分别结合目的蛋白和待测试蛋白3使用带有不同荧光标记的二抗对目的蛋白和待测试蛋白进行标记4经洗涤后使用荧光显微镜观察荧光信号定位情况✅技术优势操作简单成本低蛋白互作信号可视化可用于组织切片互作检测体内水平加分指数☆☆双分子荧光互补Bi-molecular Fluorescence Complementary, BiFC通过将荧光蛋白如Venus或YFP分割为两个无荧光活性的片段VN和VC分别与待测蛋白X/Y融合表达。当X与Y发生互作时VN和VC片段因空间邻近重构完整荧光蛋白结构在激发光下发射特征荧光表征蛋白互作情况。✅技术流程1分别构建目的蛋白和待测试蛋白的融合表达质粒2将两个表达质粒共转染至细胞3通过荧光显微镜或者流式细胞仪检测细胞阳性信号✅技术优势可实时监测活细胞内蛋白互作的时空动态通过荧光信号直接定位互作发生的细胞器或区域具有高灵敏度与特异性显著降低假阳性能够用于弱/瞬时互作捕获可通过多色荧光蛋白分割实现多对互作同步分析。体内水平加分指数☆☆荧光素酶互补实验Luciferase Complementation Assay, LCA基于荧光素酶如Firefly Luciferase被拆分成的两个无活性片段N-Luc与C-Luc分别与靶蛋白A和B融合。当A与B发生互作时N-Luc与C-Luc因空间邻近恢复酶活性催化底物荧光素氧化并产生可检测的生物发光信号其强度与蛋白互作程度正相关。✅技术流程1分别将N-Luc和C-Luc分别连接至靶蛋白A/B构建融合表达质粒2将质粒共转染至细胞并培养3加入荧光素底物通过化学发光仪检测发光强度。✅技术优势实时定量检测活细胞或体内互作动态无需裂解细胞保留天然互作环境高通量兼容性适用于药物筛选或突变体互作分析灵敏度高可检测弱/瞬时互作。体内水平加分指数☆☆☆☆☆荧光共振能量转移Fluorescent Resonance Energy TransferFRET是指当两个荧光发色基团在足够靠近时以特定波长的光激发供体分子能够通过偶极子相互作用将能量转移到邻近的受体分子并使其能量发生变化产生荧光实现能量共振转移。✅技术流程1分别构建带有不同荧光标签的目的蛋白和待测蛋白表达质粒2将表达质粒转染至细胞并培养3根据分析流程分别进行荧光激发和信号采集4荧光显微镜采集图像并分析FRET效率。✅技术优势细胞活体生理状态下检测分子间相互作用或者分子构象变化将蛋白互作信号转化为荧光信号实现蛋白互作可视化荧光信号灵敏度高可实现单细胞检测可检测单个分子的构象变化能够与多种仪器或者技术方法结合如与高分辨率显微镜、流式细胞仪、色谱技术等联合使用。体内水平加分指数☆☆☆☆☆邻位连接实验Proximity Ligation AssayPLA是利用不同种属的特异性抗体分别识别靶蛋白和待测试蛋白使用偶联特异性寡核苷酸探针PLA探针的二抗结合一抗PLA探针经滚环扩增RCA进行荧光标记通过荧光显微镜检测荧光信号分析蛋白互作。✅技术流程1准备组织切片或者固定好的细胞样本2使用不同种属的抗体结合目的蛋白和待检测蛋白3加入带有PLA探针的二抗与一抗结合4PLA探针形成连接子并进行滚环扩增5使用荧光显微镜进行可视化检测和分析✅技术优势兼具ELISA的特异性和荧光PCR的灵敏度将蛋白互作信息转化为荧光信号实现蛋白互作可视化通过DNA扩增放大蛋白互作信号灵敏度高可检测瞬时蛋白互作可进行蛋白磷酸化、乙酰化等修饰检测可应用于病理切片或大规模样本检测体内水平加分指数☆☆☆☆邻近标记技术Proximity Labeling, PL将具有邻近标记功能的酶如过氧化氢酶APEX、APEX2和HRP生物素连接酶BioID、Turbo ID以及BASU等与目标蛋白融合通过邻近标记酶催化的共价修饰的方式将生物素标记到目的蛋白附近的蛋白分子上从而分析与目的蛋白存在相互作用的蛋白信息。✅技术流程1构建目的基因与生物素连接酶的融合蛋白表达质粒2WB检测融合表达质粒蛋白表达效果3将融合表达质粒转染至细胞4转染48 h后加入适量生物素孵育5收集细胞并提取总蛋白6利用链霉亲和素-琼脂糖富集生物素标记的蛋白7Western blot检测或者质谱鉴定。✅技术优势生物素结合特亲和力强不依赖IP级别的抗体和体外纯化的蛋白具有空间分辨率能够检测分子间的动态相互作用能够实现原位标记分析互作的空间性能够检测瞬时相互作用或弱相互作用体外水平加分指数☆☆☆酶联免疫吸附实验Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA利用双抗体夹心法定量检测蛋白互作。将捕获抗体固定于酶标板捕获目标蛋白A后加入蛋白B若二者互作则通过检测抗体偶联酶标记物特异性识别蛋白B加入底物后酶催化显色反应光密度值与互作强度成正比。✅技术流程1将蛋白A的捕获抗体包被于酶标板2使用BSA封闭非特异性位点3加入蛋白A与待测蛋白B共孵育4加入酶标检测抗体及底物进行显色5终止反应使用酶标仪测定OD值。✅技术优势高灵敏度适用于低丰度蛋白互作检测高通量支持批量样本同步检测操作简单标准化试剂盒及流程精准定量标准曲线实现互作强度的定量比较低样本消耗适合珍贵或微量样本高特异性通有效降低非特异性结合干扰