在蛋白质相互作用研究中免疫共沉淀Co-IP能告诉你“谁和谁结合”却无法告诉你“在哪里结合”近年CNS等高分杂志使用的邻位连接技术Proximity Ligation Assay, PLA于2002年由Ulf Landegren团队提出并不断改进能在原位将蛋白质的相互作用转化为肉眼可见的荧光信号。邻近连接技术Proximity Ligation AssayPLA是一种基于抗体识别与DNA扩增的高灵敏度蛋白质检测技术。它通过空间邻近依赖的DNA连接与扩增将蛋白质相互作用或翻译后修饰事件转化为可定量的荧光信号。PLA最大的特点是看得见的蛋白互作即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。PLA的核心原理是当两个目标蛋白或修饰位点的间距小于40 nm时偶联特异性抗体的DNA探针会相互靠近经连接酶催化形成环状DNA模板再通过滚环扩增添加荧光信号。具体来说是将不同种属来源的特异性抗体一抗结合至目的蛋白A和B随后偶联了互补的寡核苷酸PLA探针的抗体二抗结合至一抗然后利用滚环扩增RCA法进行PCR扩增最后通过标记寡核苷酸与扩增子内的互补序列杂交在荧光显微镜下观察PLA信号。蛋白A和B存在互作则PLA探针足够接近可与连接子在DNA连接酶的作用下形成封闭的环状DNA在DNA聚合酶介导的RCA扩增下合成连环序列扩大序列信号最终在荧光显微镜下观察到荧光信号。1、超高灵敏度滚环扩增实现信号放大1000倍可检测单分子级别的目标蛋白。2、原位可视化直接在细胞或组织原位捕获互作事件保留亚细胞定位信息3、高特异性需双抗体双DNA探针同时结合靶标有效规避抗体非特异性吸附导致的假阳性。4、样本适用广泛适用于多种样本类型包括FFPE组织、穿刺活检等微量样本可兼容IF/FISH等其他标记技术。实验流程参考Duolink® PLA实验方案1、样品准备培养细胞并制备细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定10-30 min再用0.2% Triton X-100进行透化处理。对于石蜡包埋组织切片需预先进行脱蜡与水化处理。2、样本封闭在每个样品上添加封闭液确保覆盖整个样品然后将载玻片置于37°C预热的湿盒中孵育30-60 min。PS禁止使用与一抗同物种的同型 IgG 作为封闭剂会引发 PLA 探针非特异性结合产生假阳性斑点信号。3、一抗孵育用抗体稀释液分别稀释两种一抗必须来自不同物种如兔源和鼠源。吸弃封闭液后将一抗滴加到样品上37°C孵育2-3 h或4°C孵育过夜。PS两种一抗必须是不同种属如鼠源和兔源一抗须经过PLA、IHC、ICC或IF验证确保高特异性。4、PLA探针孵育吸弃一抗并洗涤载玻片2次每次5 min。按试剂盒说明书稀释PLUS和MINUS PLA探针并滴加到样品上37°C孵育1 h。5、连接反应用纯水稀释连接缓冲液将连接酶按说明书比例添加至连接缓冲液中。洗涤玻片后滴加含连接酶的连接溶液然后置于预热的湿盒中37°C孵育30 min。6、滚环扩增用纯水稀释扩增缓冲液将聚合酶按说明书比例添加至扩增缓冲液中洗涤玻片后滴加含聚合酶的扩增缓冲液然后置于预测的湿盒中37°C避光孵育100 min。7、封片与成像扩增结束后使用洗涤缓冲液彻底洗涤玻片待样本自然晾干后使用含DAPI的封片剂封片在共聚焦显微镜或荧光显微镜下采集图像。PLA信号显示为红色核显示为蓝色。A为阳性对照。B为没有一抗的阴性对照。1、固定剂的选择固定剂选择取决于样本类型PLA兼容丙酮、乙醇、福尔马林、甲醇、多聚甲醛以及锌固定液2、透化处理使抗体进入细胞结合抗原需要根据固定方式与样本类型选择去污剂PLA兼容Triton X-100、NP40、Tween-20和洋地黄皂苷等去污剂丙酮和甲醇固定时会同步进行透化无需额外透化处理。3、抗原修复抗原修复的目的是解除固定过程中被交联遮蔽的抗原表位修复方式直接影响抗体结合效率。热诱导抗原修复HIERTrilogy 缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、EDTA 缓冲液、高 pH Tris 缓冲液酶诱导抗原修复PIER蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶处理。4、封闭操作封闭的目的是减少抗体的非特异性结合降低背景信号。Duolink® PLA 试剂盒自带配套封闭液与抗体稀释液可最大程度降低抗体、寡核苷酸探针的非特异性结合。5、一抗孵育需针对待测样本摸索一抗最优孵育条件建议先通过 IF/IHC 完成单种一抗条件摸索双抗体系需分别单独优化两种一抗且最终样本处理条件需同时适配两种抗体PS选择抗体亚型为IgG优先选择亲和纯化抗体降低交叉反应6、对照设置每个PLA实验都应包含阴性对照和阳性对照阴性对照仅加单一一种一抗或两种一抗都不加用于验证信号的特异性阳性对照使用已知存在蛋白互作的样本验证整个实验体系是否正常工作7、湿盒操作每次孵育都必须将载玻片放在预热的湿盒中进行防止样本干涸。样本干燥会导致严重的背景信号和非特异性结合。8、洗涤要充分每一步孵育之后都要充分洗涤移除未结合的抗体和探针。洗涤不彻底会显著增加背景信号。9、避光操作从加入荧光标记的检测探针开始所有操作都需避光进行防止荧光淬灭。1、信号弱或无信号抗体失效或特异性不足、连接酶或聚合酶失活导致目标蛋白丰度过低会影响信号强弱。此外固定或透化过度会抗原表位导致信号减弱或无信号。2、背景信号过高封闭不彻底或洗涤不充分导致抗体或探针浓度过高以及样本干燥也会导致背景信号过高。3、信号点过多或聚集RCA扩增时间过久探针浓度过高导致产物过度扩增信号点聚集合并。图像采集时显微镜参数调整不当也会导致信号过度曝光。